清胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜上皮紧密连接的保护作用

赵 光，张淑坤，崔乃强

清胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜上皮紧密连接的保护作用

赵 光1，张淑坤2，崔乃强1

目的：探讨清胰颗粒对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠黏膜上皮紧密连接的保护作用。方法：24只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、SAP组和清胰颗粒组。采用3.5%牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射制备SAP大鼠模型，清胰颗粒组于造模前2 h、造模后6 h和18 h分别给予清胰颗粒灌胃，SAP组以同样的方法给予安慰剂。各组分别于造模后24 h取末端回肠，HE染色,光镜下观察病理组织学改变,采用Chiu’小肠组织损伤评价标准对肠黏膜损伤进行评价,应用Western blot和实时荧光定量PCR法检测回肠黏膜上皮紧密连接蛋白（Occludin）表达。结果：与假手术组相比，SAP组大鼠Chiu’小肠组织损伤评分（4.6±0.6）vs（0.0±0.0）明显升高，与SAP组相比，清胰颗粒组Chiu’小肠组织损伤评分（2.0±0.4）vs（4.6±0.6）明显降低；Western blot和实时荧光定量PCR结果显示,与假手术组相比SAP组大鼠Occludin蛋白表达（1.2±0.4）vs（3.2±0.4）和mRNA表达（1.3±0.3）vs（2.9±0.5）明显降低（P＜0.05）；与SAP组相比，清胰颗粒组Occludin蛋白表达（4.1±0.4）vs（1.2±0.4）和mRNA表达（4.2±0.3）vs（1.3±0.3）明显升高（P＜0.05）。结论：清胰颗粒能减轻SAP大鼠肠黏膜损伤程度，这一作用可能与增强肠黏膜紧密连接蛋白Occludin表达有关。

清胰颗粒；重症急性胰腺炎；紧密连接蛋白；Occludin

肠道不仅是消化和吸收营养素的器官，还是阻止肠腔内细菌、毒素等有害物质侵入体内的重要屏障，其功能是否完善对危重疾病的发生、发展和转归起着极为重要的作用。重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）时的肠道细菌移位和肠源性内毒素血症，是导致胰腺坏死后继发感染和出现SIRS、MODS等并发症主要原因，Swaroop等[1]的研究表明，胰腺单纯无菌性坏死者死亡率达10%，而伴有感染者高达25%。肠黏膜屏障是由完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞的连接构成，肠上皮细胞紧密连接是细胞间的主要连接方式，主要由Occludin、Claudin和Zos等结构蛋白与各类连接蛋白分子共同组成[2]。本实验观察了中药清胰颗粒对SAP大鼠肠黏膜上皮的保护作用及对紧密连接蛋白Occludin表达的影响。

1 材料和方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠24只，体质量(250±50)g，由中国医学科学院实验动物研究所提供（编号：SCXK京2005-0013）。

1.2 主要试剂及仪器 牛磺胆酸钠购于美国Sigma公司。清胰颗粒（柴胡、黄芩、大黄、芒硝、厚朴、枳实、元胡、川楝、甘遂末由南开医院药剂室制备，浓度为500 g/L。Occludin抗体购于美国Labvision公司。总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Promege公司。实时荧光定量PCR反应混合液（real-time master mix）购自北京Tiangen公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 模型制备及给药方法 24只健康雄性Wistar大鼠随机分为3组：假手术组、SAP组和清胰颗粒组。术前禁食不禁水24 h。采用3.5%牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射法制备动物模型[3]，假手术组以同样方法注射生理盐水。SAP组和清胰颗粒组分别于造模前2 h、造模后6 h和18 h按5 g/kg分别给予安慰剂和清胰颗粒灌胃。

1.4 标本采集及检测 于造模后24 h在距回盲部5cm取末端回肠，一半行HE染色，光镜下观察病理组织学改变，并采用Chiu’小肠组织损伤评价标准对肠黏膜损伤进行评价[4]，另一半-80℃保存用于mRNA和蛋白提取。

1.5 实时荧光定量PCR 取100μg回肠组织匀浆液按试剂盒说明提取总RNA。经纯度鉴定和浓度测定后，取1.0μg总RNA行逆转录。Occludin正义链为5'-GGAACACATTTATGATGAACAGC-3'，反义链为5'-CACGGACAAGGTCAGAGGAA-3'；HPRT正义链为5’-CATGTTTGTGTCATCAGCG-3’，反义链为5’-ACTAAGTAGATGGCCACAG-3’。25μL反应体系，退火温度55℃，40个循环。Occludin基因的mRNA的相对表达量=2-ΔCt，ΔCt=[Ct(Occludin)-Ct(HPRT)]。

1.6 Western-blot 用裂解液抽提总蛋白，测定蛋白浓度，按20μg/孔进行SDS-PAGE电泳，结束后电转移至PDVF膜；含5%脱脂奶粉的1×TBS溶液室温封闭;分别加Occludin或β-actin一抗温育过夜；相应二抗温育，洗膜，加ECL发光剂对胶片曝光；使用凝胶成像分析系统对目的条带进行扫描和密度分析，以相应蛋白条带的平均光密度值来表示Occludin的相对蛋白表达水平。

2 结果

2.1 回肠组织病理学 光镜下假手术组大鼠肠黏膜形态结构完整，模型组肠黏膜和黏膜下层充血、水肿、糜烂和中性粒细胞浸润，肠绒毛高度缩短，顶端上皮有片状坏死、脱落，黏膜厚度变薄，腺体减少；治疗组亦可见上述表现，但损伤程度较模型组明显减轻（图1）。SAP组大鼠Chiu'小肠组织损伤评分（4.6±0.6）明显高于假手术组（0.0±0.0），清胰颗粒组Chiu'小肠组织损伤评分（2.0±0.4）明显低于SAP组（4.6±0.6）差异均有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 回肠Occludin蛋白和mRNA表达 Western blot分析各组在65 kDa处均可见特异性的蛋白条带，对各条带进行灰度分析发现SAP组Occludin（1.2± 0.4）水平较假手术组低下，清胰颗粒组Occludin表达（4.1±0.4）较SAP组升高，差异有统计学意义。

实时定量PCR分析 SAP组Occludin mRNA（1.3±0.3）水平较假手术组低下，清胰颗粒组Occludin mRNA表达均（4.2±0.3）较SAP组升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1，图2）。

表1 3组大鼠回肠组织损伤评分和Occludin基因表达（±s）

表1 3组大鼠回肠组织损伤评分和Occludin基因表达（±s）

注：与同时点假手术组比较，aP＜0.05；与同时点SAP组比较，bP＜0.05

组别假手术组SAP组清胰颗粒组n 8 8 8 Chiu’评分0.0±0.0 4.6±0.6a2.0±0.4a、b Occludin蛋白表达3.2±0.4 1.2±0.4a4.1±0.4bOccludin mRNA表达2.9±0.5 1.3±0.3a4.2±0.3b

图2 各组大鼠回肠Occludin蛋白表达

3 讨论

近年来人们逐渐认识到消化道除了传统的消化，吸收功能外，还是一个作用独特，机能复杂的免疫器官。由众多的皱褶，隐窝和绒毛构成的消化道黏膜是人体内最大的膜结构。其总面积接近网球场大小。而消化道仅借一层薄薄的上皮将腔内大量细菌和毒素与体内环境隔开。在健康人体中，这些细菌和毒素绝少进入循环。人们将消化道的这一特殊的防御功能称为肠道屏障（intestinal barrier function）或黏膜屏障（mucosal barrier）功能[5]。肠黏膜屏障由完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接构成，细胞之间的连接有很多的方式，如紧密连接(tightjunctino，TJ)、缝隙连接(gap junction，GJ)、黏附连接(adherence junetion，AJ)以及桥粒(desmosome)等，而TJ是细胞间最重要的连接方式[6]，紧密连接具有将上皮细胞联合成整体的机械作用，加强细胞间的连接，使细胞不易受破坏。现已证明有多种蛋白质参与紧密连接的形成，根据不同作用可将这些蛋白分为结构蛋白(如Occludin、Claudin、JAM等)和调节蛋白(如E钙黏素、肌动蛋白、肌球蛋白、Cingulin等)；其中Occludin是组成紧密连接的重要结构蛋白之一，该蛋白数量和分布的变化不仅能直接影响紧密连接的结构和功能[7]，还能参与TJ形成的信号调节[8-9]。

SAP的发病机制及病理生理变化很复杂，现在认识到肠道细菌易位和肠源性内毒素血症是导致胰腺坏死后继发感染和出现多脏器功能不全等并发症主要原因[10]。SAP时的肠屏障功能障碍一方面直接导致肠道细菌易位至坏死胰腺组织继发胰腺感染[11]，另一方面肠道细菌内毒素进入体循环，刺激已活化的单核细胞和巨噬细胞，促进其释放细胞因子和炎症介质，后者导致全身炎症反应综合征，对机体造成第二次打击[12]。Yasuda等[13]报道大鼠SAP发病后6 h肠黏膜开始出现通透性变化，18 h后发生细菌易位.因此，早期预防和治疗肠屏障功能障碍对于改善SAP患者的预后至关重要。针对急性胰腺炎时如何保护肠屏障功能，避免肠道通透性增加及菌群紊乱，促进肠功能恢复，减少肠道细菌和内毒素易位成为研究的热点。SAP时由于肠道内产生大量内毒素和炎症因子，肠黏膜组织水肿、缺血、坏死，Occludin、Occludin、Claudin和ZOs等紧密连接结构蛋白被破坏，从而引起肠道屏障功能障碍，导致肠道内毒素、细菌进入血循环，诱发和加重全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征，使得SAP患者死亡率居高不下[14]。因此早期预防和治疗肠屏障功能障碍对于改善SAP患者的预后至关重要。

我们选用具有通里攻下、理气开郁、活血化瘀等功用的清胰颗粒（清胰颗粒为天津市南开医院崔乃强教授根据多年临床经验方，由清胰汤Ⅰ号与大陷胸汤合并而成）为研究药物。其中大黄性苦寒入阳明泻热通腑为君，大黄不仅对大鼠肠黏膜有保护作用，而且可以促进肠黏膜杯状细胞增生，分泌黏液保护肠黏膜，阻止毒素与上皮细胞接触，从而对肠黏膜完整性有较好的保护作用[15]。同时，能降低内毒素所致的胃肠道微血管的通透性，减轻肠壁水肿，保护黏膜屏障，降低黏膜通透性，抑制肠道细菌易位和内毒素的吸收，还能减少细胞因子过度释放，恢复炎症机制的平衡状态，降低过度的免疫反应[16]；黄芩、柴胡专入少阳疏邪透表为臣，厚朴、积实承气导滞为佐，另配疏肝理气、行气止痛之品元胡、川楝，诸药合用，和解少阳，内泻热结，使少阳与阳明合病得以双解；甘遂具有通里攻下、泻水逐饮的作用。研究发现[17]，甘遂组患者腹痛缓解时间、肠鸣音恢复时间均较假手术组有显著性缩短，血尿淀粉酶、体温及白细胞计数恢复时间也较假手术组显著减少，证实甘遂不仅能促进胃肠道积聚的宿垢、毒素排出，而且还可吸收腹腔内液体和毒素自肠道排出，有促进胃肠蠕动，促进SAP患者腹膜炎的消退及腹水消失，缓解全身中毒症状作用。在临床观察中发现：清胰颗粒通过保护肠屏障，减少了细菌移位，降低SAP患者血清中内毒素、TNF-α，IL-6等炎症介质水平[18]。既往研究表明，清胰颗粒能减轻SAP大鼠小肠黏膜损伤程度，降低肠黏膜通透性，保护肠黏膜屏障[3]，这一作用与促进SAP大鼠肠黏膜Claudin-1表达有关[19]。

本研究结果显示，清胰颗粒在降低SAP大鼠Chiu’小肠组织损伤评分的同时，还能提高紧密连接蛋白Occludin基因的mRNA和蛋白表达水平。转录和翻译过程的加快，使得机体合成和分泌更多数量的紧密连接结构蛋白，有助于尽快修复SAP时肠上皮细胞之间已被破坏的紧密连接，维持肠黏膜屏障功能。这一研究结果还提示清胰颗粒对肠黏膜屏障的保护作用，可能与整体上调一组而不是单个与紧密连接相关的结构蛋白的表达和合成有关。因此我们认为经过早期应用清胰颗粒在治疗过程中可以提高Occludin蛋白水平的表达，保护肠屏障，降低肠道通透性，减少细菌内毒素易位，以此来缓解胰腺炎症的进一步发展和防止胰腺炎组织的感染，降低死亡率。

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（收稿：2014-05-26 修回：2014-11-12）

（责任编辑 王 丰）

Effect of Qing Yi Particles on Intestinal Mucosal Tight Junction Protein Expression in Rats with Severe Acute Pancreatitis

ZHAO Guang，ZHANG Shu-kun，CUI Nai-qiang.
Tianjin Nankai Hospital，Tianjin (300100)，China

Objective To investigate the effects of Qingyi particles on the intestinal mucosal tight junction protein in rats with severe acute pancreatitis(SAP).MethodsTwenty-four healthy male Wistar rats were randomly divided into 3 groups：sham-operation group,SAP group and QingYi particle group.The SAP group and QingYi particle group were retrogradely cholangiopancreatographically injected with 3.5%sodium taurocholate to establish SAP model.QingYi particle group was given orally Qingyi particles at 2h before induction of SAP and 6h and 18h after induction of SAP.The SAP group was given placebo in the same times.At 24h,the small intestine tissue damage was examined by HEstaining and Chiu evaluation standard,the expression of Occludin was detected by using Western blot and real-time quantitative PCR respectively.ResultsThe ileum histopathological Chiu scores in the rats of SAP group were significantly higher than those in sham-operated group（4.6±0.6 vs 0.0±0.0），The ileum histopathological Chiu scores in the Qingyi particle group were lower than those in the SAP group（2.0±0.4vs4.6±0.6）; Compared to sham-operated group，the levels of Occludin protein（1.2±0.4vs3.2±0.4）and mRNA（1.3±0.3vs2.9± 0.5）in SAP group were significantly lower（P＜0.05）；Compared to SAP group，the levels of Occludin protein（4.1±0.4vs1.2±0.4）and mRNA（4.2±0.3vs1.3±0.3）in Qingyi particle group were significantly higher（P＜0.05）.ConclusionQingyi particles can reduce the SAP rat intestinal mucosa damage degree,the effect may be related to enhance intestinal mucosa tight junction associated protein Occludin expression.

Qing Yi particles;severe acute pancreatitis;tight junction protein;occludin

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2014)06-0611-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.06.012

1.天津市南开医院肝胆胰外科一（天津 300100）

2.天津南开医院急腹症研究所（天津 300100）

崔乃强，E-mail：nctsui@126.com