氢气能减少人肺上皮细胞系缺氧/复氧损伤后炎性因子释放

刘军肖，韩晨燕，付国俊

(1.河北省人民医院呼吸内科，河北石家庄050051;2.河北省直机关第一门诊部保健科，河北石家庄050051;3.沧州市人民医院皮肤科，河北沧州061000)

肺部良好的血液循环是组织细胞摄取氧及保证细胞生存的基本条件，肺部缺血、缺氧诱发过度的炎性反应，是肺损伤重要病理过程［1］。近年来，研究发现氢气具有抗炎作用，减轻缺血再灌注损伤等炎性因子过量释放［2］。本实验拟探讨氢气对肺细胞缺氧复氧损伤后炎性反应的影响，进一步证明氢气对肺细胞缺氧复氧后炎性因子的作用。

1 材料与方法

1.1 材料:BEAS-2B 人正常肺上皮细胞(中国科学院细胞库)。缺氧培养箱为长沙华曦电子科技有限公司生产的YCP-50S 三气培养箱，使用99.9 % N2。ELISA 试剂盒(R＆D公司)。肺细胞系A549(ATCC 公司)。DMEM(Invitrogen 公司)。

1.2 细胞培养及分组:细胞应用含10%胎牛血清的DMEM培养。当细胞汇合后，消化、传代，细胞传代3 次后，用于实验。富氢液的制备:将含10%胎牛血清的DMEM 培养基置于高纯氢气环境中，0.4 MPa 压力下加压暴露4 h，至氢气溶解于培养基达到饱和状态，放于4 ℃贮存备用。实验开始后，将H/R 和H/R+H2组细胞于缺氧培养箱中培养60 min，后于正常培养箱中继续培养30 min。分为4 组:Con:对照组;Con +H2:对照+氢气组;H/R:缺氧/复氧损伤组;H/R+H2:缺氧/复氧损伤+氢气组。实验结束后，收集细胞及培养液备用。

1.3 检测指标:MTT 法检测细胞活力:将细胞接种于96 孔板，应用MTT 和DMSO，在酶联免疫检测490 nm 处吸光度值。炎性因子浓度的测定:采用ELISA 法，检测TNF-α、IL-1β 和HMGB1 浓度，严格按照说明书要求进行。用Western blot 法测定NF-κB 的表达:收集细胞蛋白，进行凝胶电泳、转膜、封闭后，用NF-κB 单克隆抗体及二抗进行孵育。然后显色、曝光，以获得蛋白表达量。

1.4 统计学分析:所有实验数据均采用SPSS18.0 统计软件进行统计，测定结果以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较。

2 结果

与Con 和Con+H2组相比，H/R 组缺氧/复氧后MTT 检测细胞活力值降低(P＜0.05)，早期炎性因子TNF-α、IL-1β和NF-κB 蛋白表达明显增加(P＜0.05)，晚期炎性因子HMGB1 无明显变化;与H/R 组缺氧/复氧损伤后相比，给予氢气处理的H/R +H2组MTT 值明显增加(P＜0.05)，早期炎性因子TNF-α、IL-1β 和NF-κB 蛋白表达明显减少(P＜0.05)，晚期炎性因子HMGB1 无明显变化(图1，2，3)。

图1 氢气对肺细胞缺氧/复氧后细胞活力的影响Fig 1 The effect of hydrogen on cell-activity after H/R of cell

3 讨论

肺损伤导致的缺血对机体影响主要是由于缺血导致组织氧摄入不足，使细胞内大量有害物质聚集，如炎性因子、趋化因子等，引起细胞生长受限，甚至死亡，对机体造成不可逆转损伤。从本实验结果显示，给予肺细胞缺氧处理后，细胞生长受到明显抑制，说明肺细胞摄入氧不足，导致大量有害代谢产物堆积，致使细胞不能正常增殖、生长。

图2 氢气对肺细胞缺氧/复氧后NF-κB 表达的影响Fig 2 The effect of hydrogen on the NF-κB expression after H/R of cell

图3 氢气对肺细胞缺氧/复氧后早、晚期炎性因子表达的影响Fig 3 The effect of hydrogen on the expression of early and late inflammatory factors after H/R of cell

氢气具有抗炎作用，可以减轻多种疾病的炎性因子过量释放。可以明显减轻肺移植后的炎性因子释放，对移植肺具有明显保护作用［3］。

TNF-α 和IL-1β 作为早期炎性介质，可迅速诱发细胞损伤、死亡，进而引起机体损害。HMGB1 具有晚期炎性介质作用，可以诱发有害物质释放，而过量的早期炎性因子可诱发HMGB1 大量释放。NF-κB 是调节炎性介质和细胞因子释放的核转录因子。本实验结果提示，缺氧可诱发肺细胞释放大量的早期炎性因子TNF-α 和IL-1β，可增强NF-κB 表达，对晚期炎性介质无明显影响。氢分子处理后，炎性因子释放减少，NF-κB 表达减少。

综上所述，氢气可以减轻缺氧诱发的肺细胞炎性反应，可以减轻早期炎性介质的释放，机制可能与调节转录因子NF-κB 的表达有关。

［1］De Perrot M，Liu M，Waddell TK，et al．Ischemia-reperfusion-induced lung injury［J］．Am J Respir Crit Care Med，2003，167:490-511．

［2］Xie KL，Yu YH，Zhang ZS，et al．Hydrogen gas iproves survival rate and organ damage in zymosan-induced generalized inflammation model［J］．Shock，2010，34:495-501．

［3］Mao YF，Zheng XF，Cai JM，et al．Hydrogen-rich saline reduces lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats［J］．Biochem Biophy Res Commun，2009，381:602-605．