不同时期花粉症患者外周血淋巴细胞亚群的数量变化及其临床意义

刁 颖，孙劲旅，汤 蕊，顾建青，李 挚

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院变态反应科，北京100730)

花粉症属Ⅰ型变态反应，特应性患者因接触变应原花粉而引起过敏性鼻炎、哮喘等症状，其过敏症状的发作与花粉的播散季节相吻合，具有明显的季节性和地域性。在中国北方地区，蒿属花粉是夏秋季最重要的气传花粉之一，这种花粉引起的花粉症是中国最常见的过敏性疾病。目前花粉症的研究主要集中在流行性调查、花粉致敏蛋白、食物交叉过敏和中医治疗等方面［1-5］，而对花粉症患者不同时期，即花粉季节的发作期和非花粉季节的非发作期之间的免疫机制研究不多，特别是两期患者体内免疫细胞的变化。本研究用自身对照方式，检测2013年8 ～12月北京协和医院变态反应科门诊诊治的花粉症患者发作期和非发作期外周血淋巴细胞亚群含量，以期进一步探讨体内免疫细胞在蒿属过敏花粉症患者发作期和非发作期的功能状态和临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

2013年8 ～9月份，秋季花粉症患者症状发作期，在北京协和医院变态反应科门诊就诊的33 例花粉症患者;非花粉季节(11 ～12月份)作为非发作期，对33 例患者进行召回随访，其中20 人成功回访，均无任何症状，也未使用药物治疗，男性11 例，女性9 例，平均年龄为(34.5 ±8.6)岁(25 ～62 岁)。其中14 人为单纯过敏性鼻炎，6 人为过敏性鼻炎合并哮喘。本次研究经北京协和医院伦理委员会审核通过，所有入组对象均签署知情同意书。

入组花粉症患者均符合以下条件:

1)至少有2年由蒿为主要致敏花粉引起过敏性鼻炎有/无季节性哮喘的病史;2)对蒿的皮内试验呈阳性反应，至少为+ +;3)蒿血清sIgE ＞3 级，可合并其他花粉过敏，尘螨、真菌血清sIgE 为0 级;4)采血前至少停用抗组胺药物3d 和类固醇激素1个月;5)未患有上下呼吸道感染和其他器质性疾病。

1.2 主要试剂

溶血素，Multitest 6-color TBNK Kit，单克隆抗体APC-Cy7-CD3、PerCP-CD4、PE-Cy7-CD8、PE-CD28、APC-CD38 及同型对照抗体(BD 公司)。

1.3 方法

用真空采血管分别抽取花粉症患者发作期与非发作期的EDTA 抗凝静脉全血4 mL，2 mL 用于外周血细胞计数，采用全自动血液分析仪(XS-800i，上海希森美康医用电子有限公司)检测;2 mL 用于外周血淋巴细胞亚群分析，采用北京协和医院感染科临床诊断实验室流式细胞仪(FACS CantoⅡ，BD 公司)检测。每管加入全血100 μL、CD3、CD4、CD8、CD28 和CD38 单克隆抗体各10 μL 进行标记，避光孵育15 min，加入500 μL 溶血素，避光溶血15 min，加入2 mL PBS，1 500 r/min，离心5 min，弃上清，重复1 次，加入750 μL PBS 混匀上机检测，同时设同型阴性对照。T 细胞、B 细胞和NK 细胞检测参照TBNK 试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0 软件进行统计，所测数值用均数±标准差(±s)表示。配对资料要求进行正态性方差齐性检验，满足正态方差齐时，发作期与非发作期比较采用配对t 检验，不满足正态方差齐时采用配对Wilcoxon 秩和检验。

2 结果

2.1 花粉症患者外周血细胞计数比较

花粉症患者发作期与非发作期外周血细胞计数结果(表1)显示，花粉症发作期外周血嗜酸性细胞和嗜碱性细胞明显高于非发作期(P＜0.01)，发作期嗜酸性细胞与蒿血清sIgE(39.02 ±36.73)呈正相关关系(P＜0.01)。

2.2 花粉症患者外周血淋巴细胞亚群分析

花粉症患者发作期与非发作期外周血淋巴细胞亚群结果(表2，图1)显示，花粉症患者外周血NK 细胞计数非发作期高于发作期(P＜0.05)。CD4+CD28+T 细胞和CD8+CD28+T 细胞计数发作期高于非发作期，特别是CD8+CD28+在两期之间比较有显著性差异(P＜0.05)。CD8+CD38+T 细胞计数发作期显著高于非发作期(P＜0.05)。

表1 花粉症患者外周血细胞计数Table 1 The peripheral bloodcounts of thehayfever patients(±s，109/L，n=20)

表1 花粉症患者外周血细胞计数Table 1 The peripheral bloodcounts of thehayfever patients(±s，109/L，n=20)

＊P＜0.01 compared with non-onset group．

groupleukocytelymphocytemonocyteneutrop hilbasophileosinophil non-onset6.62 ±1.492.22 ±0.610.44 ±0.173.7 1 ±1.240.03 ±0.020.18 ±0.10 onset7.28 ±1.692.23 ±0.560.43 ±0.124.11 ±1.360.05 ±0.02*0.46 ±0.21*

表2 花粉症患者外周血淋巴细胞亚群绝对计数Table 2 The lymphocyte subsets counts of peripheral blood in hay fever patients(±s，cells/μL，n=20)

表2 花粉症患者外周血淋巴细胞亚群绝对计数Table 2 The lymphocyte subsets counts of peripheral blood in hay fever patients(±s，cells/μL，n=20)

*P＜0.05 compared with non-onset group．

groupB cellNK cellCD3 +T CD3 +CD4 +T CD3 +CD8 +T CD4+CD28+T CD8 +CD28 +T CD8 +CD38 +T CD4/CD8 non-onset 298 ±144 282 ±143 1 627 ±464 652 ±269441 ±143629 ±274250 ±91173 ±631.60 ±0.70 onset308 ±118 221 ±114* 1 694 ±470 696 ±253489 ±188671 ±256304 ±136*233 ±95*1.55 ±0.58

图1 采用流式细胞术对花粉症患者外周血淋巴细胞亚群分析Fig 1 Flowcytometric analysis of peripheral blood lymphocyte subsets in hay fever patients

3 讨论

花粉症由患者接触致敏花粉引起，主要表现为鼻部和/或呼吸道症状，以肥大细胞和嗜碱性细胞表面IgE 高亲和力受体(FcεRI)与IgE 抗体结合，激活释放炎性介质，引起嗜酸性细胞浸润为特点。嗜酸性细胞是过敏性炎性反应的主要效应细胞，现已知IL5 对嗜酸性细胞有分化、聚集和激活作用，阻断IL5 可明显降低过敏患者外周血嗜酸性细胞含量［6］。嗜碱性细胞不仅作为过敏炎性反应效应细胞，还有始动炎性反应和抗原提呈作用［7-8］，并参与IgG 介导的严重过敏反应［9］。本研究中花粉症患者发作期外周血嗜酸性和嗜碱性细胞显著升高，嗜酸性细胞与sIgE 呈正相关，提示外周血嗜酸性和嗜碱性细胞可作为过敏性疾病辅助指标，发作期外周血嗜酸性细胞和嗜碱性细胞浓度升高，可能致使局部病变如鼻黏膜的嗜酸性和嗜碱性细胞含量增高。

淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的细胞群，根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分成3 大类，以CD3+为标志的T 淋巴细胞(T 淋巴细胞分为CD4+T 细胞和CD8+T 细胞)、B 淋巴细胞和NK 细胞。CD4+T 细胞主要为Th 细胞亚群，Th1/Th2 失衡与过敏性炎性反应密切相关［10］。CD8+T细胞具有免疫抑制和维持机体内环境稳定性的功能。比较分析花粉症不同发作时期CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴细胞和CD4/CD8 的表达，结果显示发作期和非发作期表达均处于同一水平，均在正常参考范围内，提示花粉症虽然是一种与机体免疫变化相关的疾病，但与免疫功能密切的淋巴细胞的变化仍在机体可调节范围内，并不像系统性红斑狼疮(SLE)等导致免疫系统产生严重的不可逆变化，另一方面由于本研究患者主要为过敏性鼻炎，可能主要表现在局部鼻黏膜的免疫细胞改变，而与外周血淋巴细胞变化无关，导致淋巴细胞无显著变化，但在临床评价机体免疫状态时多检测外周血淋巴细胞亚群。NK 细胞是机体重要的免疫细胞，通过分泌不同的细胞因子参与过敏炎性反应，NK 细胞现已分为多种亚群，包括与Th1 细胞相似的NK1 和与Th2 细胞相似的NK2，NK1 和NK2 细胞失衡与过敏性疾病有关［11］。本研究显示非发作期NK 细胞高于发作期，可能表明花粉症患者非发作期外周血中NK 细胞多为NK1 亚群。

CD28 分子是T 淋巴细胞的协同刺激信号受体，CD38 是存在于许多免疫细胞表面的糖蛋白，通过对激活信号的传导，促进T 细胞的增殖和激活，可作为细胞活化标志［12-14］。本研究显示发作期CD8+CD28+和CD8+CD38+T 细胞升高，提示发作期花粉症患者部分免疫细胞处于激活状态，由此推测如果抑制发作期免疫细胞的激活状态，可能会有效减轻患者的过敏症状，本研究能够为过敏性疾病的此类治疗提供理论基础。

志谢:感谢北京协和医院感染科李太生主任对实验的指导和实验室邱志峰、谢静老师在技术上的支持。

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