超声间歇辅助酶解对虾下脚料蛋白的工艺优化

钱清华

（连云港职业技术学院，江苏连云港222006）

超声间歇辅助酶解对虾下脚料蛋白的工艺优化

钱清华

（连云港职业技术学院，江苏连云港222006）

采用超声波间歇协助胰蛋白酶水解对虾下脚料蛋白制备低分子肽。以水解度为指标，利用Box-Behnken中心组合设计原理和响应面分析法，对酶解工艺条件进行了优化，建立了加酶量、超声波处理次数（时间）、酶解温度与水解度之间的数学模型。结果表明，最佳工艺条件为：加酶量为46.42 kat/g，超声处理次数为3次，每次5min，间歇10min，酶解温度为44.3℃，在此条件下水解度为62.21%，与理论计算值60.65%基本一致。水解产物中必需氨基酸含量占氨基酸总量的44.5%；构成肽的氨基酸占总氨基酸的比例为85.6%，低分子肽是蛋白水解液的主要成分。

对虾下脚料蛋白；酶解；超声波；水解度

对虾营养丰富，富含糖元、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等成分，脂肪含量低，且多为不饱和脂肪酸，蛋白质容易消化吸收。随着我国对虾养殖业的迅猛发展，虾产量不断增加，生产的虾多数用于加工成无头虾仁，而占虾体重量30%～40%的虾头被剔除，其中大部分被用于生产饲料，大大降低了虾的利用价值。虾头含有脑磷脂、卵磷脂、维生素、Ca、P、Fe、Zn以及类胡萝卜素、蛋白质和脂肪等营养成分。因此，虾头综合利用是提高虾利用价值的重要途径[1-4]。有关虾粉[5]、虾壳[6]、虾下脚料[7]等的研究受到广泛关注。将水产动物蛋白尤其是海产品蛋白酶解后，其中不再含易致过敏的蛋白和嘌呤，解决了部分人群不适用的问题，可以应用于方便食品、休闲食品、高档调味料和营养强化食品。

在前期工作的基础上，把超声波技术应用到对虾下脚料蛋白酶解过程中，采用间歇超声处理，以水解度为指标，在单因素试验的基础上用响应面分析法对酶解工艺条件进行优化，制备营养丰富的蛋白酶解液，经过浓缩后得到多肽和氨基酸粉末。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

胰蛋白酶：国药集团化学试剂有限公司，酶活力为833.33 kat/g；对虾下脚料蛋白：自制；氢氧化钠、盐酸均为分析纯。

1.2 主要仪器

JJ-2型组织捣碎匀浆机：江苏省金坛市江南仪器厂；TD4型电动离心机：湖南仪器仪表总厂离心机厂；PHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；电热恒温水浴锅：江苏金坛大地自动化仪器厂；OYA-A120超声器（150W，28 KHz）：苏州欧亚超声波设备有限公司；Agilent1100高效液相色谱仪：安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 超声波辅助酶解

将虾下脚料提取牛磺酸和生物锌[8]后，在剩余的虾蛋白质湿料中，加入3倍体积的纯水，调节pH至7.0，加热至一定温度后，加一定量的胰蛋白酶，并超声波处理5min，超声波功率为80W，间隔10min后，再用超声处理5min，如此操作，保持该温度酶解一定时间，通过加入1mol/L的NaOH溶液调节pH，使pH稳定在7.0，酶解完成后将酶解液加热至95℃，并保持10min，灭酶。

1.3.2 分析方法

总氮测定：采用GB 5009.5—2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定。

式中：V1为样品滴定消耗盐酸标准溶液的体积，mL；V0为空白滴定消耗盐酸标准溶液的体积，mL；C为标准盐酸溶液的浓度，（mol/L）；m为样品质量，g；0.014为1mol/L盐酸标准滴定溶液相当氮的质量，g。

游离氨基酸含量测定：采用高效液相色谱分析，按JY/T019-1996《氨基酸分析方法通则》、GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定方法》。

氨基氮测定：采用中性甲醛电位滴定法[9]。

式中：V1′为样品消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；V0′为空白消耗NaOH标准溶液的体积，mL；c为NaOH标准溶液的浓度，（mol/L）；m为样品的质量，g。

水解度计算：

1.3.3 酶解工艺优化

选取对酶解工艺有显著影响的酶用量、超声处理次数和酶解温度3个主要因素进行单因素试验，结果说明水解度最大的条件分别是：酶用量为41.67 kat/g，超声处理次数3次，酶解温度45℃。在单因素试验结果的基础上，进行正交回归试验，利用Box-Behnken的中心组合设计原理，进行响应面法中的Box-Behnken实验，以酶用量（U/g蛋白质）、超声处理次数、酶解温度（℃）3个因素为自变量，分别用X1，X2，X3表示，以水解度为响应值，每一个自变量的低、中、高试验水平分别以-1，0，1编码，考察各因素对提取工艺的影响和因素间的交互作用，确定最佳的酶解条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 因素水平编码表Table1 Test codeand correspondingly origin level

2结果与分析

2.1 试验结果

按照表1方案进行试验，所得水解度结果见表2。

表2 试验设计及结果Table2 Box-Behnken design and corresponding experimental results

模型共设17个试验，其中有12个析因试验，5个中心试验。析因试验构成三维定点，中心试验为区域的中心。从表中可以看出，水解度最高值为61.3%。比文献报道的单酶水解蛋白的水解度高，这是因为超声辅助的作用，超声产生的瞬间内爆的强烈振动波，能形成短暂的高能环境，这些能量可以打开化学键，利于蛋白分子的分解。

2.2 模型建立

运用Design-Expert软件对上述结果进行多元拟合，得到加酶量（X1）、超声处理次数（X2）、酶解温度（X3）与水解度（DH）关系的回归方程预测模型为：

对拟合的二次回归模型方程求一阶偏导，令导数等于0，得X1=0.57，X2=0.61，X3=-0.07。即加酶量为46.42kat/g，超声处理次数为2.61次，酶解温度为44.3℃，水解度计算值为60.65%。该模型的R2=0.9101，RAdj2= 0.794 4，表明该模型与实际拟合较好。信噪比8.142高于临界值4，表明二次多元回归模型极其显著。

2.1.3 方差分析

对试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型的方差分析Table3 Analysis of variance of the regression model

从表3中可见，自变量（加酶量、超声处理次数、温度）与响应值（蛋白水解度）之间线性关系显著。回归方程各项的方差分析结果还表明，加酶量、超声处理次数的一次项均达到极显著水平（P＜0.01），加酶量的二次项、超声处理次数的二次项、温度的二次项均达到高度显著水平（P＜0.05）；模型的失拟P值为0.229 2，大于0.05，不显著，说明该模型的失拟结果较好。误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合度较好。根据F值的大小，可以判定各试验因素对响应值的影响依次是：X1〉X2〉X3。即酶用量影响最大，超声处理次数影响次之，酶解温度影响相对较小。因此，可以用该模型回归方程代替真实试验点对试验结果进行分析。

2.1.4 响应面分析

通过响应面图形可以看出各试验因素对响应值的影响，进一步研究变量之间的交互作用以及确定最优点。图1是加酶量与超声次数（时间）对水解度的影响，图2是加酶量与酶解温度对水解度的影响，图3是温度与超声次数（时间）对水解度的影响。从响应面三维图可知，在所选范围内存在极值，即响应面最高点。

图1 加酶量与超声处理次数对水解度影响的响应曲面和等高线图Fig.1 Response surface chart and contour showing the effects of enzyme dosage and ultrasonic treatment on degree of hydrolysis

由图1可见，响应曲面的坡度相对较为陡峭，表明响应值（蛋白水解度）受温度和超声次数（时间）的影响比较大。当加酶量在43.75 kat/g～56.67 kat/g之间，超声次数在2.2～3.8次范围内对蛋白水解度最有利，从等高线可直观看出两因素间有交互作用，但影响不显著。

图2 加酶量与温度对水解度影响的响应曲面和等高线图Fig.2 Response surface chart and contour showing the effects of enzyme dosage and hydrolysis temperature on degree of hydrolysis

图3 酶解温度与超声处理次数对水解度影响的响应曲面和等高线图Fig.3 Response surface chart and contour showing the effects of hydrolysis temperature and ultrasonic treatment on degree of hydrolysis

由图2可以看出：随着温度的升高，蛋白水解度呈现先上升后下降的趋势；随着酶用量的增加，蛋白水解度也呈先上升后缓慢下降的趋势。在温度的变化范围处于38℃～48℃、加酶量45.83 kat/g～56.67 kat/g范围内，蛋白水解度较高，从等高线可直观看出两因素的交互作用比超声处理次数和加酶量的交互作用稍弱。

由图3可以看出，响应曲面的坡度在超声处理坐标显示相对较为陡峭，表明响应值（蛋白水解度）对超声处理次数的改变较为敏感，而对温度的敏感度较小，在温度的变化范围处于37℃～47℃、超声处理2.8～3.8时，蛋白水解度有较大值，从等高线可看出两因素的有交互作用。

2.1.5 回归模型的验证试验

采用上述优化条件进行水解度试验，以检验响应面分析所得结果的可靠性，水解条件为加酶量46.42kat/g，超声处理次数3次，每次5min，间歇10min，酶解温度44.3℃，在此条件下试验3次，水解度平均为62.21%，与理论水解度60.65%基本一致，表明该模型很好的反映了胰蛋白酶水解工艺参数的可行性。

2.3 水解产物的氨基酸组成分析

将水解产物进行氨基酸组成分析，结果如表4所示。

表4 酶水解产物的氨基酸分析Table4 Analysisamino acid of hydrolysate g/100 g

从表4可以看出，水解产物中含17种游离氨基酸，色氨酸未检测，其中，必需氨基酸含量占氨基酸总量的44.5%；在必需氨基酸中，亮氨酸的含量最高，为1.085mg/g。天冬氨酸、谷氨酸等鲜味氨基酸含量丰富。构成肽的氨基酸占总氨基酸的比例为85.6%，游离氨基酸占总氨基酸的比例为13.4%。因此，水溶性低分子肽是蛋白水解的主要成分。

3结论

利用间歇超声作用方法辅助酶水解对虾下脚料蛋白，经过响应面分析，得到最佳水解工艺条件为：胰蛋白酶用量为46.42 kat/g，超声处理次数为3次，每次5min，每次间歇10min，酶解时间共为45min，酶解温度44.3℃，水解度为60.65%；在此工艺条件下验证实验，试验3次的水解度平均值为62.21%。水解产物中，水溶性低分子肽是带鱼水解蛋白的主要成分，必需氨基酸含量占氨基酸总量的44.5%；构成肽的氨基酸占总氨基酸的比例为85.6%，游离氨基酸占总氨基酸的比例为13.4%。本方法能缩短酶解时间，降低能耗，降低成本，在用于生产功能食品的原料方面具有实用价值。

[1]Kim S-K,Mendis E.Bioactive compounds from marine processing byproducts-A review[J].Food Research International,2006,39：383-393

[2]Kim,SK,Wijesekara I.Development and biological activities of marine-derived bioactive peptides：A review[J].Journal of functional foods,2010(2)：1-9

[3]崔秀明,汪之和,施文正.南极磷虾粗虾油提取工艺优化[J].食品科学,2011,32(24)：126-129

[4]Valdez-Peña AU,Espinoza-Perez JD,Sandoval-Fabian GC,etal. Screening of industrial enzymes for deproteinization of shrimp head for chitin recovery[J].Food Science and Biotechnology,2010,19(2)：553-557

[5]韩晓祥,郭小旬,励建荣.中国对虾调味料风味前体物质酶解制备工艺研究[J].中国食品学报,2012,12(4)：100-106

[6]吴求林,郑宝东.响应面法优化虾壳酶解的工艺[J].福建农林大学学报：自然科学版,2011,40(1)：80-84

[7]钱清华.一种从虾头及虾下脚料中同步提取牛磺酸和甲壳素及多肽的方法.中国,201210137815.5[P].2012-05-07

[8]钱清华.从对虾头及虾下脚料中提取生物锌和牛磺酸的工艺优化[J].食品科技,2013(1)：308-312

[9]黄伟坤.食品分析与检验[M].北京：中国轻工业出版社,1995：56-63

Optimization of Hydrolysis of Prawn Leftover Protein Using Trypsin Assisted by In term it tent Ultrasonic Method

QIANQing-hua
（Lianyungang Technological College，Lianyungang222006，Jiangsu，China）

The protein of prawn leftover was hydrolyzed with trypsin assisted by intermittent ultrasonic method for preparing low molecular weight peptides.Taking hydrolysis degree as response values，the mathematical regression model of the relationships between the studied factors and the degree of hydrolysis of protein was constructed by means of the principles of Box-Benheken central composite experimental design and response surface analysis.Results showed that the optimum hydrolysis conditions was based on trypsin-catalyzed reaction by intermittent treatment with ultrasonic for3 times at44.3℃and 46.42 kat/g protein enzyme dose，5min every time and 10min intermittent.Under these conditions，the degree of hydrolysis was62.21%，which was close to the estimated value60.65%obtained by using regression model.The hydrolysate contains essential amino acids，whose content was44.5%of the totalamino acids.The amino acids constituted peptides were 85.6%of the total amino acids.The low molecular weight peptides were the main components of hydrolysate.

prawn leftover protein；enzymatic hydrolysis；ultrasonic；degree of hydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.019

2013-11-12

江苏省高校科研成果产业化推进工程项目（JH10-66）

钱清华（1965—），女（汉），教授，博士，主要从事海洋生物资源的开发利用技术研究。