密蒙花黄色素性质研究

杨胜远，李卓文，赖演莲，方晓旋，陈晓屏，杨娜

（韩山师范学院生物学系，广东潮州521041）

密蒙花黄色素性质研究

杨胜远，李卓文，赖演莲，方晓旋，陈晓屏，杨娜

（韩山师范学院生物学系，广东潮州521041）

对密蒙花黄色素的性质进行了研究。结果表明，密蒙花黄色素易溶于水，难溶于石油醚，在不同溶剂中的溶解性为水＞无水乙醇＞丙酮＞石油醚。密蒙花黄色素在4、30℃、pH4.92～9.18范围内稳定，但高温、光和EDTA对其色价有一定影响。密蒙花黄色素具有较强DPPH自由基清除能力，每毫克密蒙花黄色素与10.01μg Trolox自由基清除能力相当。在10 g/L的浓度下，密蒙花黄色素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、副溶血性弧菌、酿酒酵母、匍枝根霉、黑曲霉和桔青霉均没有抗菌活性。

密蒙花；黄色素；性质

食用色素主要用于改善食品色调和色泽，在提高食品感官品质、增进食欲等方面具有重要作用。合成色素具有品质均一、色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、无臭无味、易于溶解和拼色的优点，在食品加工业曾被广泛采用，然而合成色素具有潜在危险性，一些国家相继制定了一系列限制合成色素使用的法规，发达国家则禁止使用合成色素。因此，亟待开发安全性高的天然食用色素。

密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）别名黄饭花、小锦花、蒙花、疙瘩皮树花、鸡骨头花、羊耳朵等，为双子叶植物药马钱科（Loganiaceae）醉鱼草属（Buddleja）植物密蒙花的花序，分布于福建、广东、广西、湖南、安徽、湖北、四川、贵州、云南、陕西、甘肃等地，含有丰富的黄酮类化合物和藏红花甙，有清肝利尿、明目退热、抗菌消炎、镇静止咳之功效[1-2]，在中国西南壮族、布依族、傣族及汉族地区常用它作食品染色剂，以其制作的黄色米饭色泽鲜亮、自然，具有密蒙花花朵的清香[3]。民间的长期食用实践和现代毒理学研究[4]均表明密蒙花黄色素具有极高的安全性，是一种最有希望的天然植物黄色素。

本文旨在对密蒙花黄色素的性质进行探讨，以期为密蒙花黄色素的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

密蒙花花序采自广西田林县潞城镇，晒干后备用；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillus niger）和桔青霉（Penicillium citrinum）均为韩山师范学院食品与发酵研究所保藏菌种；2，2–二苯基–1–苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），奎诺二甲基丙烯酸酯（（±）-6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox），购自美国Sigma公司，编号分别为D9132和238813；其余化学药品或试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

UV-2450紫外-可见分光光度计：日本Shimadzu公司生产。

1.3 培养基

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基[5]；霉菌采用PDA培养基[5]；酵母采用YPD培养基[6]；副溶血性弧菌采用3％氯化钠碱性蛋白胨水（APW）[7]。

1.4 方法

1.4.1 原料处理

将密蒙花花序的花于50℃热风烘干，粉碎后过60目筛密闭保存。

1.4.2 密蒙花黄色素的制备

称取密蒙花10 g于圆底烧瓶中，加入70％乙醇200mL，在瓶口接上冷凝管，然后于60℃冷凝回流浸提15min，冷却后减压抽滤，滤液于55℃旋转蒸发浓缩后进行冷冻干燥，置于变色硅胶干燥器恢复至常温备用。

1.4.3 密蒙花黄色素色价测定

参照文献[8]修改后进行测定。称取待测天然色素样品0.1 g，用50％乙醇溶解并定容至100mL，然后以50％乙醇进行适当稀释，再用1 cm比色皿，以50％乙醇溶液做参比，于435 nm测定稀释液的吸光值A，然后按①式进行计算色价：

式中：E1cm435 nm为密蒙花黄色素在435 nm处测定的色价，（U/g）；A为密蒙花黄色素稀释液在435 nm处的吸收值；V为密蒙花黄色素溶液的体积，mL；f为密蒙花黄色素溶液的稀释倍数；m为密蒙花黄色素的质量，g。

1.4.4 密蒙花黄色素溶解性

称取100mg黄色素于带塞试管，分别加入1mL蒸馏水、无水乙醇、丙酮、石油醚，旋涡混匀2min，常温放置30min，观察溶解情况。

1.4.5 光线对密蒙花黄色素稳定性的影响

将密蒙花黄色素溶于蒸馏水配制成1 g/L溶液，于4℃冰箱保存，间隔5天取样，适当稀释后于435 nm测定吸收值A，并换算为色价。

1.4.6 温度对密蒙花黄色素稳定性的影响

将密蒙花黄色素溶于蒸馏水配制成浓度为1 g/L溶液，分别于4、30、80℃保温，间隔2 h取样，适当稀释后于435 nm测定吸收值A，并换算为色价。

1.4.7 pH对密蒙花黄色素稳定性的影响

将密蒙花黄色素分别溶于蒸馏水、pH4.92和pH9.18磷酸盐缓冲液（1/15mol/L）配制成浓度为1 g/L溶液，于80℃保温，间隔2 h取样，用相应溶剂进行适当稀释，然后以相应溶剂作为参比于435 nm测定吸收值A，并换算为色价。

1.4.8 EDTA对密蒙花黄色素稳定性的影响

将密蒙花黄色素溶于蒸馏水配制成浓度为1 g/L溶液，分别取40mL与10mL蒸馏水、10mLEDTA溶液（500mg/L）混匀，于4℃冰箱保存，间隔5 d取样，适当稀释后于435 nm测定吸收值A，并换算为色价。

1.4.9 密蒙花黄色素清除DPPH自由基活性测定

DPPH自由基清除实验加样情况见表1。

表1 DPPH自由基清除实验加样表Table1 Sample table of radical DPPH·scavenging activity assay

参照文献[9]略作修改后进行测定。用蒸馏水配制1 g/L密蒙花黄色素溶液，用50％乙醇配制200μmol/L DPPH溶液和浓度分别为20、40、60、80、100μmol/L的Trolox溶液，然后按表1加样，加入DPPH液之后，常温反应在20min，测定520 nm的吸光值A。

通过（2）式计算Trolox溶液和密蒙花黄色素样品液的自由基清除率，以Trolox浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标绘制标准工作曲线。通过计算得到的密蒙花黄色素样品液的自由基清除率，在标准曲线上找出其相对应的Trolox浓度，可换算成Trolox当量（μg/mg），表述为每毫克密蒙花黄色素（干基）相当于Trolox的微克数。

1.4.10 密蒙花黄色素抗菌活性测定

将密蒙花黄色素配制成10 g/L水溶液，然后采用管碟法[10]测定其对靶菌的抑菌活性。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈直径表示抗菌活性。供试靶细菌、酵母及霉菌孢子密度均大于108CFU/mL，细菌于37℃培养24 h，酵母和霉菌于30℃培养60 h。

2 结果

2.1 密蒙花黄色素溶解性

经对密蒙花黄色素在不同溶剂中的溶解性进行考察，结果表明：100mg密蒙花黄色素在1mL不同溶剂中溶解程度为水＞无水乙醇＞丙酮＞石油醚，黄色素易溶于水，全部溶解，而在石油醚中几乎不溶，石油醚无黄色。该结果与文献[11]研究结果相符。

2.2 光线对密蒙花黄色素稳定性的影响

光线对密蒙花黄色素稳定性的影响见图1。

图1 光对密蒙花黄色素稳定性的影响Fig.1 Effect of light on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

将密蒙花黄色素水溶液（pH为4.79）于自然光下贮存（4℃），结果密蒙花黄色素在前5天，色价有所下降，然后趋于稳定（图1）。

文献[11]研究表明密蒙花黄色素在pH4～7时对自然光稳定，而文献[12]认为密蒙花黄色素溶液在pH7.0和pH9.0时对日光具有较高的稳定性，但在pH4.0时对日光的稳定性较差。本文结果与文献[11-12]略有差异，可能由于密蒙花黄色素中的不同成分对光的稳定性不一致，因此出现色价先降后稳定的现象。

2.3 温度对密蒙花黄色素稳定性的影响

温度对密蒙花黄色素稳定性的影响见图2。

图2温度对密蒙花黄色素稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

图2 显示，4℃和30℃保藏的密蒙花黄色素的色价基本不变，但80℃处理的黄色素随着保温时间延长，色价逐渐降低，说明高温对密蒙花黄色素的稳定性有一定影响。

文献[12]表明密蒙花黄色素在80℃以下时稳定，100℃处理对黄色素稳定性有一定影响，但色素残存率仍有95.5％，与图2结果不符，这是由于文献[12]只保温2h，处理时间较短所造成。文献[11]考察了不同温度对密蒙花黄色素的稳定性，认为在测试温度下温度对色素性能的影响甚微，色素对温度变化有一定的耐受力，其结论也与本研究结果有差异。从文献[11]的结果可见随着在40℃～80℃保温时间延长，黄色素的吸收值也逐步下降，但由于文献[11]也只在不同温度下处理3 h，因此吸光度的变异系数不大。

2.4 pH对密蒙花黄色素稳定性的影响

pH对密蒙花黄色素稳定性的影响见图3。

图3 pH对密蒙花黄色素稳定性的影响Fig.3 Effect of pH on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

结果表明，经80℃处理，不同pH的密蒙花黄色素的色价都随着处理时间增加而下降，而且下降的速度基本一致，说明色价下降是由温度造成，而pH对密蒙花黄色素的稳定性基本没有影响。

2.5 EDTA对密蒙花黄色素稳定性的影响

EDTA对密蒙花黄色素稳定性的影响见图4。

图4 EDTA对密蒙花黄色素稳定性的影响Fig.4 Effect of EDTA on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

结果表明，随着保藏时间增加，添加EDTA的黄色素溶液的色价逐渐下降，而无EDTA存在的黄色素溶液的色价在45 d内基本不变，说明EDTA对密蒙花黄色素色价有一定影响。

文献[11]表明CuSO4对密蒙花黄色素有一定协同作用，AlCl3可降低黄色素的吸收值，但变异系数不大；文献[12]表明NaCl和AlCl3对密蒙花黄色素的色泽影响不大，但FeCl3影响较大。EDTA能络合金属离子，常用于防止金属离子对色素的影响，但图4结果表明EDTA对密蒙花黄色素的稳定性有一定影响，因此不适宜在密蒙花黄色素中使用。为了预防Fe3+对密蒙花黄色素的影响，应从Fe3+介入途径加以控制较为适宜。

2.6 密蒙花黄色素清除DPPH自由基活性

密蒙花中存在多种黄酮类化合物，如刺槐素、芹菜素、木犀草素、密蒙花新甙、蒙花甙、木犀草素-7-O-葡萄糖甙和秋英甙[13]，黄酮类化合物具有较好的抗氧化活性。文献[14]对密蒙花总黄酮进行了研究，表明密蒙花对DPPH自由基清除作用比VC强，文献[15]也表明密蒙花总黄酮具有羟自由基的清除作用和对羟自由基诱发卵磷脂脂质过氧化具有抑制作用。

经对密蒙花黄色素清除DPPH自由基活性进行测定，结果密蒙花黄色素溶液（1 g/L）对DPPH自由基具有一定清除能力，自由基清除率为81.11％，每mg密蒙花黄色素与10.01μg Trolox的DPPH自由基清除能力相当。研究结果表明密蒙花黄色素具有较强的自由基清除能力，与文献[13-15]相符，说明在黄色素提取过程中，密蒙花大部分总黄酮已被提取出来，因此密蒙花黄色素的使用以粗提物较好，无需纯化。

2.7 密蒙花黄色素抗菌活性测定

文献[16]表明密蒙花总黄酮和总苯乙醇甙在细胞水平上有明显的抗菌（金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌）活性，其活性成分为密蒙花甙和洋丁香甙，文献[17]以拓扑异构酶Ⅳ为靶点，对中药密蒙花的化学成分（包括单体化合物和提取分离有效部位和流分）进行抗菌活性筛选，结果显示石油醚部位、醋酸乙酯部位、大孔树脂40％乙醇洗脱部位和单体成分芹菜素、异洋丁香甙、密蒙花甙、洋丁香甙以及songaroside A对拓扑异构酶Ⅳ有较强的抑制作用。

经对10 g/L密蒙花黄色素水溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、副溶血性弧菌、酿酒酵母、匍枝根霉、黑曲霉和桔青霉的抗菌活性进行测定，结果表明密蒙花黄色素水溶液对测试菌株均没有抗菌活性。

3 讨论

密蒙花是我国西南各省民间用来制作黄色米饭的传统药食两用植物，长期实践及现代毒理学研究均表明，密蒙花具有极高的安全性，着色力强，染色效果好，色泽稳定，在食品工业具有极高的应用价值[18]。文献[19]认为密蒙花含有多种氨基酸、微量元素、A-藏花素，4＇，5，7–三羟基黄酮，甘露糖醇及醉鱼草甙等成分，对人体有营养和保健作用，色素提取物可不经纯化而直接使用。本文研究也表明密蒙花黄色素粗提物中含有清除DPPH自由基的活性成分，如果对密蒙花黄色素进行纯化，必然会造成这些活性成分的丢失，因此作者赞成文献[19]观点。

图1及图2关于光和温度对密蒙花黄色素的研究结果与文献[11-12]结果略有差异，主要由于研究中测定时间差异所造成，这也表明对于物质稳定性研究，应该尽量长时间进行监测，才能获得更客观的数据。

文献[16-17]研究表明密蒙花成分具有抗菌作用，然而本文对密蒙花黄色素提取物对多种微生物的抗菌作用进行了检测，均未见密蒙花黄色素提取物具有抗菌活性。文献[17]研究表明，密蒙花的抗菌成分主要存在于石油醚、醋酸乙酯等有机相溶剂部分，而本文中提取的密蒙花黄色素为水溶性色素，难溶于丙酮和石油醚，这可能是本文研究结果与文献[16-17]不同的主要原因之一，同时密蒙花提取物的浓度差异也会造成抗菌活性测定结果不同。从本文研究结果可见，即使密蒙花黄色素具有抗菌活性，其活性也十分微弱，在实际应用可以忽略。

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Studies on the Properties of Yellow Pigment from Buddleja officinalis Maxim

YANG Sheng-yuan，LI Zhuo-wen，LAI Yan-lian，FANG Xiao-xuan，CHEN Xiao-ping，YANG Na
（Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

The properties of yellow pigment from Buddleja officinalis Maxim were investigated.The results indicated the yellow pigment from B.officinalis Maxim was easily dissolved in water and poorly soluble in petroleum ether，and the solubility of the yellow pigment in different solvents was water＞absolute ethyl alcohol＞acetone＞petroleum ether.The yellow pigment was stable at4，30℃and pH 4.92-9.18，but its stability was effect by high temperature，light and EDTA.The yellow pigment shows strong DPPH radical scavenging activity which was equal to10.01μg Trolox/mg，and shows no antimicrobial activities to Escherichia coli，Staphyloccocus aureus，Bacillus subtilis，Vibrio Parahemolyticus，Saccharomyces cerevisiae，Rhizopus stolonifer，Aspergillus niger and Penicillium citrinum at10 g/L.

Buddleja officinalis Maxim；yellow pigment；property

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.005

2013-07-24

国家星火计划项目（2011GA780022）；潮州市科技引导计划项目（2011N01）；韩山师范学院教授科研启动项目（QD20110304）

杨胜远（1972—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品微生物及功能性食品。