几种含芳香环天然化合物清除自由基的活性

王天山，邢彦彬，谭志勇，唐望昌，苏美多，叶飞，李雯雯，宋小平

（海南省热带药用植物化学省部共建重点实验室海南师范大学化学与化工学院，海南海口571158）

几种含芳香环天然化合物清除自由基的活性

王天山，邢彦彬，谭志勇，唐望昌，苏美多，叶飞，李雯雯，宋小平*

（海南省热带药用植物化学省部共建重点实验室海南师范大学化学与化工学院，海南海口571158）

探讨含芳香环抗氧化剂不同取代基对其抗氧化活性的影响，选择研究了五种含有苯环的天然化合物（Diayangambin，鹅掌楸树脂醇A二甲醚，N-反式-阿魏酰基酪胺，香兰素和没食子酸三甲醚）对自由基的清除能力，以邻苯三酚的自氧化产生的超氧阴离子及Fenton反应产生的羟基自由基作为模拟自由基，以VC作为对照品，采用紫外分光光度法测量这五种化合物对这两种自由基的清除作用。实验结果显示，各种天然化合物对这两种自由基的清除率均随浓度的增大而增加，其中前四种物质对超氧自由基的清除活性基本与VC相当，而没食子酸三甲醚对羟基自由基清除活性则最强。没食子酸三甲醚对羟基自由基的半清除浓度EC50值只有1.24×10-6mg/mL，而VC的EC50值则高达3.48×10-4mg/mL。研究发现在含苯环的抗氧化剂中，在苯环4位的取代基是甲氧基或者是羟基时对抗氧化活性的作用基本相似，而如果在苯环1位的取代基是羧基时则能明显增强其抗氧化活性。

天然抗氧化剂；没食子酸三甲醚；自由基；紫外分光光度法

自由基是含有一个不成对电子的原子团，具有强的氧化性。抗氧化剂可以清除自由基，防止食品氧化和延长食品保质期，提高食品的品质，保持原有的风味与延长物质的储存期。天然抗氧化剂的毒性远低于人工合成的抗氧化剂，其中大部分抗氧化剂均具有芳香环结构和至少有一个羟基[1]。近年来从自然界寻找天然抗氧化剂已经受到各国科学工作者的重视，其产品也得到人们的青睐[2]。前期从海南香花暗罗的提取物中分离得到五种含有芳香环的天然化合物：Diayangambin（1），鹅掌楸树脂醇A二甲醚（2），N-反式-阿魏酰基酪胺（3），香兰素（4）和没食子酸三甲醚（5）[3]。这五种化合物均含有一个或者两个苯环，其中化合物1和2属于木脂素类化合物，化合物3属于羟基肉桂酸的衍生物，化合物5是没食子酸的衍生物，此类型的化合物均在一定的程度上具有抗氧化的作用[4-7]。在这些化合物的苯环上的取代基有些是相同的，有些是不同的；本研究主要对比这些取代基对该化合物抗氧化作用的影响，为合理设计高效的抗氧化剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

盐酸（36％～38％）：分析纯，广州市东江化工厂；三羟甲基-氨基甲烷（Tris）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；邻苯三酚（PR）：ALaddin Chemistry Co. Ltd.；甲基紫，分析纯，天津市福晨化学试剂厂；维生素C：分析纯，天津市四通化工厂；H2O2（30％）：分析纯，西陇化工股份有限公司；Fe（NH4）2（SO4）2：由海南师范大学化学与化工学院分析化学实验室提供。

供试品：Diayangambin，鹅掌楸树脂醇A二甲醚，N-反式-阿魏酰基酪胺，香兰素和没食子酸三甲醚均由海南省热带药用植物化学省部共建重点实验室提供，是从香花暗罗（Polyalthia rumphii）茎皮的氯仿部位分离得到。

1.2 仪器

紫外分光光度计（UV2600型）：上海天美科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对超氧阴离子（O2-·）清除率的测定

邻苯三酚在碱性条件下自氧化并释放出O2-·，并且生成有色的中间产物；当有清除剂存在时，可与O2-·反应，从而阻止中间产物的积累。因此可以通过测定溶液的吸光值在加入清除剂前后的变化来判断清除剂的清除效果。按表1进行溶液配置，分别得到等量的空白溶液、供试品溶液和本底。量取4mL空白溶液置于1 cm比色杯中，以水作对照，经紫外-可见全波长（200 nm～800 nm）扫描，在λ=321 nm处有最大吸收，因此选择321 nm作为测定波长。在配置溶液4min时测试溶液的吸光度A321。在测试供试品的吸光度A样时需要扣除本底的吸光度A底，目的是消除供试品自身在321 nm的吸收。供试品清除率的计算式为：

表1 抑制邻苯三酚自身氧化的条件Table1 Conditions of inhibiting pyorgallol autoxidation

1.3.2 对羟基自由基（OH·）清除率的测定

Fenton反应产生的OH·与甲基紫作用后使其吸光度降低，加入清除剂清除OH·后，使吸光度升高，利用反应前后吸光度值的变化来测定清除率。甲基紫溶液经紫外-可见光全波长（200 nm～800 nm）扫描，在244 nm处有最大吸收，故选择244 nm为测定波长。

量取50mL甲基紫溶液（0.3×10-3mol/L）稀释至200mL，测得反应前甲基紫溶液的吸光度为A；量取50mL甲基紫溶液（0.3×10-3mol/L），加入25mLFe2+溶液（1.0×10-3mol/L）和25mLH2O2溶液（0.1％），用100mL水稀释到200mL，测得反应后甲基紫的吸光度为A0；量取50mL甲基紫溶液（0.3×10-3mol/L），加入25mL Fe2+溶液（1.0×10-3mol/L）和25mLH2O2溶液（0.1％）混合均匀后取1.5mL与1.5mL供试品溶液混合，测得吸光度为AS。则供试品对的清除率按下式进行计算：

2 结果与分析

图1是五种供试品和维生素C对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率，其中维生素C是作为对照品。从图1可以看出，随样品溶液浓度的增大其对自由基的清除率也随之增强，并且供试品与对照品对羟基自由基的清除能力比对超氧自由基的能力强。左图显示，Diayangambin（1），N-反式-阿魏酰基酪胺（3），香兰素（4）和没食子酸三甲醚（5）对超氧阴离子自由基的清除率与维生素C基本相当，而鹅掌楸树脂醇A二甲醚（2）对超氧阴离子自由基的清除率则相对较弱，大约只有维生素C的一半。右图显示，化合物1，2，3和4对羟基自由基的清除率比维生素C弱，其强度只有维生素C的50％～60％；相比之下，化合物5对羟基自由基的清除活性最强，其半清除浓度EC50是1.24×10-6mg/mL，而维生素C的EC50则是3.48×10-4mg/mL，可见5对羟基自由基的EC50值只有维生素C的1/280，其活性远强于维生素C。

图1 供试品和维生素C对超氧自由基和羟基自由基的清除率Fig.1 Clearance rate of superoxide anion free radicals and hydroxyl radicals by samples and vitamin C

3 讨论

通过实验发现没食子酸三甲醚对羟基自由基的EC50值只有维生素C的1/280，而没食子酸对DPPH自由的EC50值是维生素C的1/5[7]；从这方面看，没食子酸三甲醚对自由基清除活性比没食子酸还要强，可见没食子酸三甲醚亦是一种强的天然抗氧化剂，具有潜在的应用价值。

在含苯环的天然抗氧化剂中，苯环的4位连一个羟基会增强其抗氧化活性的能力，有利于与自由基反应后生成稳定的半醌自由基[8]。本研究选择五种具有苯环的天然化合物作为供试品，以维生素C作为对照品，通过对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率来评价其抗氧化活性的强弱。在这五种含苯环的天然化合物中，化合物3和4的对位是羟基，而化合物1，2和5的4位是甲氧基；实验结果表明，这五种化合物对这两种自由基均具有不同程度的清除能力，这说明苯环上连有羟基或者是甲氧基时对抗氧化活性的作用基本相同。如果苯环4位连的是羟基，与自由基反应时失去氢而形成半醌自由基，如果连的是甲氧基，则可失去甲基而形成半醌自由基。在这五种抗氧化活性物质的苯环上存在明显差异的是1位的取代基，化合物1，2和3的取代基是烷基和烯基，这两种取代不能稳定半醌自由基，因此抗氧化活性不强；化合物4和5的取代基均是羰基，但是5的抗氧化活性远强于4，可能是因为5在溶液中能够通过羧基的氢键形成二聚体使半醌自由基更加稳定，而4在溶液里则主要是以游离态存在而无法使半醌自由基更加稳定。

通过比较几种含有苯环的天然化合物的抗氧化活性发现，苯环的4位是羟基或者是甲氧基不能明显影响其抗氧化活性；影响其抗氧化活性的主要因素是苯环1位的取代基，若1位连的是具有强电子效应并能使半醌自由基更加稳定的取代基（如羧基）时可明显增强其抗氧化活性。此研究结果可为如何设计强抗氧化剂提供理论依据，既可以通过修饰苯环1位上的取代基来改变其抗氧化活性，亦可以通过烷基化苯环上的羟基来增强其脂溶性。

[1]国际药用辅料网.天然抗氧化剂的研发及市场应用前景[OL]. http://news.chemnet.com/item/2010-07-27/1385774.html.2010年07月27日

[2]陆奕娜.天然抗氧化植物化学物的研究进展[J].食品研究与开发,2011,33(9):238-243

[3]Wang T S,Yuan Y,Wang J,et al.Anticancer activities of constituents from the stem of Polyalthia rumphii[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2012,25(2):353-356

[4]徐冰,杨盼盼,王佩龙,等.五味子科木脂素类化合物抗氧化活性研究[J].四川中医,2012,30(5):52-54

[5]杨玲玲,魏安池,代红丽,等.芝麻木脂素的抗氧化研究[J].粮食科技与经济,2011,36(3):51-53

[6]钱素平,张加山,姚思德,等.羟基肉桂酸衍生物清除超氧阴离子自由基研究[J].辐射研究与辐射工艺学报:自然科学版,1998,16 (3):18-21

[7]赵萍,林樱姬,金征宇,等.花生红衣中多酚类物质清除DPPH自由基能力和抑菌性能的研究[J].食品工业科技,2010,31(10):129-132

[8]马耀,张建中,丛建波,等.没食子酸及其衍生物抗氧化机制的研究[J].科学通报,1993,38(15):1411-1414

Study on the Radical Scavenging Activities by Several Natural Aromatic Compounds

WANG Tian-shan，XING Yan-bin，TAN Zhi-yong，TANG Wang-chang，SU Mei-duo，YE Fei，LI Wen-wen，SONG Xiao-ping*
（Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158，Hainan，China）

On the purpose of investigating the impact factors of anti-oxidant activities by aromatic antioxidants with different substitutents，five natural aromatic compounds（Diayangambin，Epiyangambin，N-transferuloyltyramine，Vanillin and 3，4，5-trimethoxy benzoic acid）were selected to be natural antioxidants to scavenge free radicals.The anti-oxidant activities were evaluated by UV spectrophotometry，applying vitamin C as control，and the model free radicals were superoxide anion free radical from pyrogallol autooxidation under alkaline condition，and hydroxyl radical from Fenton reaction.The experimental results showed that all five natural compounds indicated activities to these two free radicals，the former four compounds showed activities to superoxide anion free radical，which were nearly to that of vitamin C；furthermore，3，4，5-trimethoxy benzoic acid showed very strong activity to hydroxyl radical with the EC50value of1.24×10-6mg/mL，which was stronger than that of vitamin Cwith the EC50value of3.48×10-4mg/mL.By comparing the anti-oxidant activities with the relevant natural compounds，the contribution to anti-oxidant activity of methoxyl group substituting at para-position of phenyl group was similar to that of hydroxyl group.Indeed，a strong electron-attracting group（such as carboxyl group），located at the primary position of benzene ring，can strengthen the anti-oxidant activity obviously.

natural antioxidants；3，4，5-trimethoxy benzoic acid；free radicals；UV spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.002

2012-12-18

海南省自然基金项目（213018）；海南省教育厅高等学校科研项目（Hjkj2010-25）

王天山（1979—），男（汉），副教授，硕士，主要从事天然产物化学研究。

*通信作者