发酵茶叶水浸出物对PC12神经细胞保护作用

张梁，韩煜晖，秦金花

（安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，安徽合肥230036）

发酵茶叶水浸出物对PC12神经细胞保护作用

张梁，韩煜晖，秦金花

（安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，安徽合肥230036）

采用高效液相色谱（HPLC）分析普洱茶、乌龙茶、绿茶和红茶连续三次水浸泡物中茶多酚类及嘌呤类生物碱的含量。利用PC12神经细胞损伤模型比较四种茶叶提取物对于PC12神经细胞的保护作用。采用热90℃，30min/次，25倍量水，连续3次浸泡4种茶叶，第1次和第2次提取能够获得茶叶中的主要多酚类物质。普洱茶、乌龙茶、绿茶和红茶中前两次总多酚类成分的提取率为99.38％、94.50％、87.49％、99.15％，而嘌呤类生物碱的提取率为97.57％、95.81％、88.01％、97.95％。PC12神经细胞活性测试结果显示各种茶叶提取物对谷氨酸导致的神经细胞兴奋性毒性损伤具有较好的保护作用，而对过氧化氢以及BSO导致的细胞损伤并无显著影响。

茶叶；PC12神经细胞；损伤；多酚

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年人中最常见的神经退行性疾病之一，是造成痴呆的主要原因，占痴呆患者总数的2/3以上，在65岁以上人群中，西方约有5％的人患此病，我国60岁以上人群AD的患病率为3％～5％[1]。AD病因为多因素参与，发病机制尚不完全清楚。但是，一般认为神经细胞兴奋性毒性和氧化损伤是阿尔茨海默病的两个发病机理[2]。脑缺血缺氧后神经细胞的死亡是一个复杂的过程。细胞外液中谷氨酸积聚造成兴奋毒性损伤是神经元死亡的始动因素，而由于过氧化物过度聚集导致的（·O2-）自由基，导致细胞膜的脂质过氧化等一系列链式反应，也会造成细胞的凋亡[3]。

PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤，已被广泛用于神经细胞死亡方式及神经毒方面的研究[4]。鉴于许多中枢神经系统疾病的发生都与兴奋性氨基酸谷氨酸介导的神经毒性作用相关，本实验比较了各种茶叶提取物对于谷氨酸神经毒性的抑制作用。此外，GSH合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺（buthionine sulfoximine，BSO）以及过氧化氢造成神经细胞损伤模型也被用于比较各种茶叶的神经细胞损伤保护作用[5-7]。基于此，我们运用体外培养神经元的方法，初步观察了各种茶叶提取物对培养神经元存活的作用，同时在谷氨酸等多种神经毒素的神经毒损伤的基础上观察茶叶成分对该损伤是否具有保护作用。

1 材料和仪器

1.1 样品

收集市面上主流的茶叶样品，收集的样品范围包括了普洱熟茶、乌龙茶、绿茶和红茶，各种茶叶样品详细情况如表1所示。

表1 各茶叶样品来源Table1 Details of tea samples

1.2 药品与试剂

儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸（GA）、咖啡碱（CA）、可可碱（THE）标准品纯度均大于98％。

乙腈（色谱纯）为天津天津彪仕奇科技发展公司产品，自制双蒸水。

1.3 仪器

高效液相色谱仪HP 1100系列（四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，紫外检测器）：美国Agilent公司；电子分析天平BP211D：瑞士Sartorius公司；无菌超净工作台：苏州临海净化设备公司；二氧化碳培养箱（MCO-15AC）：日本SANYO公司；SUNRISE酶标仪：奥地利TECAN Austria GmbH公司。

1.4 色谱条件

色谱柱AgilentZORBAXSB-AqC18（250mm×4.6mm，5μm），带保护柱；流动相为乙腈（A）-0.6％甲酸水（B），运行时间为60min，梯度洗脱条件如下：5∶95-30∶70（0～60min）；柱温为30℃；流速为0.8mL/min；检测波长为280 nm。

1.5 样品配置

取各种茶叶粗粉（过4号筛）2.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，加入25倍量水，90℃条件下浸泡30min，每隔10分钟晃动一次，取出，补重，室温下放置20min，连续提取3次，分别取上清液过0.22μm微孔滤膜，续滤液进样5μL，HPLC检测。

取各种茶叶提取液1mL，过0.22μm微孔滤膜，收集续滤液，于40℃条件下真空干燥，采用1mL的DMSO复溶，过0.22μm微孔滤膜，作为PC12神经细胞活性测试样品。

1.6 细胞培养与测试

细胞用含体积分数为10％新生牛血清的高糖DMEM培养液，置CO2培养箱（37℃，5％CO2）培养，隔2天传代1次，取对数生长期细胞分组进行实验。PC12细胞分为对照组、模型组及各茶叶组。上述各组细胞无血清培养24 h，除对照组外，模型组给予终浓度为50μmol/L的H2O2（BSO或谷氨酸）；给药组高中低浓度分别同时给予各种茶叶水提物，孵育2 h后，再给予终浓度为50μmol/L的H2O2（BSO或谷氨酸），继续培养72 h，检测各项指标。

MTT法检测细胞活性。细胞消化后配成单细胞悬液，以每孔105个细胞接种于96孔培养板，每组8复孔，于培养结束前4小时，加入5 g/L的MTT 10μL，培养结束后，倾去培养基，每孔加入DMSO 100μL，振荡混匀，使结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm处测定其吸光度值（A值）。对照组细胞生长率为100％，其余各组存活率=各浓度组A值/对照组A值×100％。

1.7 统计学处理

采用SPSS统计软件进行统计分析，结果以x±s表示，细胞存活率表达水平组间比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 普洱茶、乌龙茶、绿茶与红茶中连续浸泡液中主要多酚类成分及嘌呤类生物碱的含量分析

HPLC分析四种茶叶经过三次热水浸提后浸提液中主要多酚类和嘌呤类生物碱的水平。如下图1所示，图1-A中主要的多酚类物质为没食子酸和没食子儿茶素，而其它多酚类成分在普洱熟茶中含量极低。经过两次提取，茶渣中主要的儿茶素类和没食子酸类成分含量极低。一些儿茶素类成分，例如EGCG、GCG、ECG、EC等在检测线以下未被检测到。

图1-B中主要的多酚类物质为ECG、EGCG、EC和EGC，而GA在乌龙茶中含量较低。经过两次提取，茶渣中主要的仍然保留了部分的茶多酚类成分，总儿茶素和没食子酸含量大于5％。与乌龙茶相比较，绿茶中前两次的提取率更低，总多酚的提取率为87.49％，两次热水浸提之后，经过两次热水提取之后的绿茶茶渣中多酚类含量总量超过10％。红茶的热水提取率与普洱茶相似，两者同为发酵茶叶，红茶中前两次的多酚提取率为99.15％，两次提取之后红茶茶渣中可利用的多酚类物质很少。

图1 普洱茶、乌龙茶、绿茶和红茶三次提取物中主要多酚类物质及嘌呤类生物碱的含量Fig.1 The contents of major polyphenols and purine alkaloids in three extracts of pu-erh tea，oolong tea green tea and black tea

2.2 普洱茶、乌龙茶、绿茶与红茶提取物对PC12神经细胞保护作用

各组PC12细胞活性的比较，经过BSO，过氧化氢和谷氨酸损伤之后，各组的PC12细胞存活率分别为（65.77±2.12）％，（42.84±0.95）％和（49.28±1.29）％，明显低于对照组（100％）（P＜0.01），表明这3种神经细胞毒性剂导致了PC12细胞损伤。与模型组比较，给予茶叶提取物组的细胞存活率如图2所示。

图2 普洱茶、乌龙茶、绿茶和红茶提取物对于BSO，H2O2和谷氨酸导致的神经细胞损伤的保护作用Fig.2 The protective effects of pu-erh tea，oolong tea，green tea and black tea on PC12 cells in jury induced by BSO，H2O2and glutamate

各种茶叶提取物对于谷氨酸所导致的神经细胞损伤具有较好的保护作用，而对于过氧化氢的过氧化损伤，以及BSO所导致的GSH合成酶抑制无明显的保护作用。

如图2所示，第1次，第2次和第3次茶叶提取物的PC12神经细胞保护作用与提取物中多酚类成分含量呈现出一定的量效关系，而且普洱茶（A）、乌龙茶（B）和绿茶（C）的作用较强，而红茶（D）的保护作用较弱。

3 小结

经过两次热水浸泡提取之后，全发酵茶叶，后发酵茶叶，以及半发酵茶中多酚类成分以及嘌呤类生物碱提取殆尽。而未发酵茶叶绿茶中前两次热水的总提取率不足90％，经过两次热水提取之后，绿茶茶渣中仍然含有10％左右的多酚类成分。结果提示在各种茶叶的深加工过程中，应当考虑茶叶类型对于茶叶提取效率的影响。

经过热水浸提之后的四种不同发酵程度的茶叶，其浸提液对于谷氨酸导致的神经细胞毒性损伤都具有较好的保护作用。谷氨酸是中枢神经系统含量最高的一种神经递质，急性细胞损伤会造成谷氨酸的大量释放，从而对神经元造成损伤。在许多神经退行性疾病中，如帕金森病和阿尔茨海默病等，谷氨酸也发着极其重要的作用。四种茶叶提取物可以抑制谷氨酸造成Ca2+离子内流神经兴奋性毒性。BSO作为一种GSH合成酶抑制剂可以提高肿瘤药物的药效，降低肿瘤细胞耐药性。在本研究中，BSO作为GSH合成酶抑制剂，可以导致神经细胞内谷胱甘肽水平下降，促进细胞凋亡。结果显示茶叶提取物对于过氧化氢和BSO所造成的神经细胞损伤无显著保护作用。

谷氨酸的神经细胞兴奋性毒性与多种神经退行性疾病相关，茶叶提取物对于PC12细胞谷氨酸损伤的保护作用提示茶叶可能具有潜在的保健作用。虽然茶叶中多酚类成分差异较大，但各种茶叶提取物都具有较好的神经细胞损伤保护作用，这可能与其中的咖啡碱有关。关于茶叶对于神经细胞损伤的保护作用机理还需要进一步的研究。

[1]田金洲,时晶,苗迎春,等.阿尔茨海默病的流行病学特点及其对公共卫生观念的影响[J].湖北中医学院学报,2009,11(1):3-7

[2]金桂芳,梅寒芳,杨红.阿尔茨海默病的发病机制及药物治疗进展[J].广东药学院学报,2006,22(6):697-700

[3]岳少杰,虞佩兰.谷氨酸的兴奋性神经毒性作用与中枢神经系统损伤[J].国际神经病学神经外科学杂志,1994,21(4):205-208

[4]贺文彬,张俊龙,陈乃宏,等.补肾方含药血清促进PC12细胞增殖及其拮抗谷氨酸神经毒作用的研究[J].中国药学,2005,14(2): 119-124

[5]孙芳玲,王文,安宜,等.莫诺苷抑制过氧化氢诱导的神经细胞损伤作用[J].中国药物与临床,2008,8(11):843-845

[6]Bharat S,Cochran B C,Hsu M,et al.Pre-treatment with R-lipoic acid alleviates the effects of GSH depletion in PC 12 cells:implications for Parkinson's disease therapy[J].NeuroToxicology,2002,23 (4/5):479-486

[7]邱瑜,陈红专,金正均.谷氨酸神经细胞毒作用的新途径——谷氨酸/胱氨酸转运体介导机制[J].中国药理学通报,2000,16(3):251-253

The Protective Effects of Fermented Teas Aqueous Extracts on PC12 Cells Injury

ZHANG Liang，HAN Yu-hui，QIN Jin-hua
（Key Laboratory of Tea Biochemistry&Biotechnology，Ministry of Education，Anhui Agricultural University，Hefei230036，Anhui，China）

Using the HPLC method，the contents of major polyphenols and purine alkaloids were determined on consecutive extracts of pu-erh tea，oolong tea，green tea and black tea for three times.PC12 cells were also introduced for the studies on the protective effects of these tea extracts.Under the extraction condition of hot water at 90 centidegree for 30 min each time，four kinds of tea were consecutively extracted for three times.The combination of first and second extracts of pu-erh tea，oolong tea，green tea and black tea account for the99.38％，94.50％，87.49％，99.15％of total polyphenols，and for 97.57％，95.81％，88.01％and 97.95％of purine alkaloids.All of four kinds of tea extracts show great protective effects on the injury of PC12 induced by glutamate，rather than buthionine sμlfoximine（BSO）and H2O2.

Tea；PC12 cells；injury；polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.001

2012-12-21

国家自然科学基金（31201335）；安徽省自然科学基金（1308085QC51）

张梁（1985—），男（汉），讲师，博士，研究方向：茶叶化学成分与功效。