三百棒对RA大鼠关节滑膜中VEGF、MMP-3表达的影响

吴朝伟，向 珊，向 敏，袁德培，袁 林

（1.湖北省恩施市中心医院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）

三百棒对RA大鼠关节滑膜中VEGF、MMP-3表达的影响

吴朝伟1，向 珊1，向 敏1，袁德培2，袁 林2

（1.湖北省恩施市中心医院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）

目的：观察三百棒对完全弗氏佐剂诱导的类风湿关节炎大鼠滑膜中血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）表达的影响，以探讨三百棒治疗类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的潜在机制。方法：用弗氏完全佐剂注射于大鼠右后肢足垫皮内致炎，制成AA大鼠模型，致炎后第21天开始进行药物干预4周。免疫组化法检测膝关节滑膜中VEGF、MMP-3表达的水平。结果：各治疗组VEGF、MMP-3的表达明显低于模型组（P＜0．05）。结论：三百棒治疗类风湿关节炎的作用机制可能抑制滑膜中VEGF、MMP-3的表达水平相关。

大鼠；类风湿关节炎模型；三百棒；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶-3

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病［1］。目前对该病的病因病机尚无定论，但研究表明免疫紊乱、细胞因子分泌失常、血管增生、关节滑膜增厚、软骨及骨的破坏可最终导致关节功能丧失。有研究发现血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在介导血管增生中起主要作用，基质金属蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases-3，MMP-3）是破坏软骨及骨的关键因素。三百棒（Toddalia asiatica）是湖北土家族地区广泛用于治疗风湿病的民族药。我们观察了三百棒对AA大鼠关节滑膜中VEGF、MMP-3的表达，总结如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及造模

AD大鼠50只，雄性，体质量（280±20）g，购买于武汉市湖北省疾病防疫控制中心实验动物中心（合格证号42000600001876），许可证号SCXK（鄂）2008-0005。

除正常组外，其余组每只大鼠于后右足皮内注射0.1mL弗氏完全佐剂（FCA）进行造模，造模方法参照参考文献［2］。各大鼠致炎后24h内出现原发性足趾肿胀高峰，1周肿胀减轻，致炎12天后出现继发性足趾关节肿胀，有些大鼠尾部伴有明显风湿结节。

1.2 药物及试剂

三百棒根皮采挖于恩施山区，在湖北民族学院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室分别提取三百棒乙醇提取液和三百棒水提取液，浓缩成1g/mL的药液，4℃冰箱保存。雷公藤多苷片购买于湖北民族学院附属民大医院门诊部，批号120603，将雷公藤多苷片研磨成粉加蒸馏水稀释成2mg/mL混悬液，放入4℃冰箱保存。弗氏完全佐剂由美国Sigma公司生产，批号Lot#13909。VEGF免疫组织化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产，批号130910。

1.3 实验方法

动物分组及给药：50只AD大鼠随机分为：正常组、模型组、雷公藤多苷片治疗组（对照组）、三百棒乙醇提取液治疗组（三醇组）、三百棒水提取液治疗组（三水组），每组10只。致炎后第21天开始进行药物干预，三醇组和三水组分别给予相应提取液3g/（kg·d）；对照组给于雷公藤多苷片6.3mg/（kg·d），正常组和模型组给与等体积生理盐水，给药体积0.01mL/g，连续4周。

标本采集：各组在末次给药后（药物干预28天），禁水禁食一晚，第2天进行标本采集。大鼠进行颈部脱臼处死，然后将大鼠浸泡在新洁尔灭消毒液中5min。于膝关节正中纵向切开皮肤，暴露膝关节，在髌骨上缘横向切断上面的肌肉和韧带，在从髌骨两侧向下分离，然后翻开髌骨，打开膝关节，可以看见髌骨下缘韧带上附着一层微黄发亮的组织，即滑膜组织，用手术刀将其分离出来。用同样的方法采集另一侧膝关节滑膜组织。

免疫组化检测：将滑膜组织放入石蜡包埋盒中，浸泡在10%福尔马林中进行固定，脱钙后进行常规石蜡包埋切片进行免疫组化实验检测滑膜中VEGF、MMP-3的表达水平。实验操作严格按照说明书进行。每张免疫组化切片随机观察5个视野并采集图片，通过计算机图像分析系统（Image Pro Plus6.0）对图片进行数据分析，得出阳性细胞的平均积分吸光度（OD值），计算均值。

1.4 统计方法

2 结 果

VEGF、MMP-3免疫组化标记均定为于细胞浆，阳性细胞的细胞浆呈棕黄色。由二者免疫组化的图像可以看见，RA模型组大鼠膝关节滑膜细胞的胞浆中布满大量的棕黄色阳性细胞颗粒。正常组滑膜细胞胞浆中棕黄色阳性颗粒分布很少且较均匀。对照组、三醇组、三水组滑膜细胞胞浆中棕黄色阳性细胞颗粒数量介于正常组和模型组之间，且与模型组相比阳性细胞数目均有不同程度的减少，见表1。

表1 各组大鼠膝关节滑膜VEGF、MMP3表达比较 （OD值，±s）

表1 各组大鼠膝关节滑膜VEGF、MMP3表达比较 （OD值，±s）

注：与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 n 用药剂量 VEGF MMP-3正常组 10 - 437.56±15.46 201.06土17.63模型组 10 - 1502.49±76.32#544.67±22.85#对照组 9 6.3mg/（kg·d） 929.89±61.86△423.99土28.19△三醇组 9 3g/（kg·d） 970.94±18.78△432.32±30.08△三水组 9 3g/（kg·d） 1017.34±18.78△436.32±27.08△

3 讨 论

目前普遍认为RA是一种血管过度增生性疾病。血管的新生是病理基础，随着血管的增生，血管翳的形成，并不断侵犯软骨和骨，最终导致关节畸形功能丧失。实验证实血管翳形成及对软骨和骨侵蚀破坏的的重要细胞因子是VEGF、MMP-3［3］。

关节滑膜中微血管增生是一个复合过程，是很多因子共同作用的结果，其中VEGF是最为重要的细胞因子。VEGF在RA早期就已经出现并持续存在疾病的全过程。研究发现RA关节滑膜最早出现的病理改变就是血管增生，大量炎症细胞和介质，如IL-l、TNF-α等可以上调VEGF的表达［4］。研究发现VEGF水表下降与临床症状改善相关，并与临床检测指标血沉、C-反应蛋白含量成正相关，RA早起表达水平越高与后期关节损伤程度越严重，在临床上应用抗VEGF治疗RA能够延缓疾病的进展，改善临床症状［5］。

研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）是在RA发病过程中起重要作用的酶类，尤其是病变后期介导关节软骨和骨的破坏［6］。其中MMP-3是检测病情活动和预测治疗关节软骨破坏程度的重要指标之一［7］。研究报道MMP3与RA病情活动相关，与RA患者血清中血沉、C-反应蛋白成正相关，在关节软骨破坏中扮演重要角色［8］。目前，RA尚不能根治，后期会导致关节畸形功能失常，所以防止关节破坏、保护关节功能也成为治疗RA的目标。只有控制滑膜血管新生，减少关节软骨降解，才能达到防治关节破坏，保护关节功能的目的。早发现早治疗及时控制病情是减少关节受损的关键。

实验发现AA大鼠模型滑膜中VEGF、MMP3表达均升高，与正常组相比有显著差异，表明二者与RA的发病关系密切。三百棒治疗组和雷公藤多苷片治疗组，滑膜中VEGF、MMP3的表达都有所降低，和模型组比较有显著差异，说明三百棒具有与雷公藤多苷片类似的作用，能抑制AA大鼠模型滑膜中VEGF、MMP3的表达，抑制关节炎发生发展，减少血管增生、软骨降解，从而改善RA病情。

［1］ 葛均波．内科学［M］．8版．北京：人民卫生出版社，2013：808．

［2］ 李仪奎．中药药理实验方法学［M］．上海科学技术出版社，2006；750-751．

［3］ Konttinen YT，Ainola M，Valleala H，et al．Analysis of 16 different matrix metalloproteinases （MMP-1 to MMP-20） in the synovial membrane：different profiles in trauma and rheumatoid arthritis［J］．Ann．Rheum．Dis，1999，58：691-697．

［4］ 谢建民，余步云，陆才生．VEGF在类风湿关节炎滑液中的表达及上调MMP-2活性的研究［J］．中华风湿病学杂志，2006，10（8）：495-497．

［5］ Cho ML，Jung YO，Min SY，et al．Interleukin-18 induces the Produetion of vaseular endothelal growth factor（VEGF） in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts via AP-l-dependent pathways［J］．Immunology Letters，2006，103（2）：159-166．

［6］ 储永良，黄清春．血管内皮生长因子及其受体与类风湿关节炎的相关性［J］．中华风湿病学杂志，2005，9（6）：359-361．

［7］ 吴志美，袁建芬，陈均．类风湿关节炎患者中GPI、MMP-3和抗CCP抗体水平的研究［J］．国际检验医学杂志，2011，15：1706-1707，1709．

［8］ 吴素玲．痹痛灵颗粒对类风湿性关节炎关节滑膜保护机理的研究［D］．南京中医药大学，2010．

Objective：to observe the effects of Ethnic drugs Sanbaibang （Toddaliae Asiaticae） on VEGF、MMP-3 in Synovial of RA Rats，and explore its potential mechanism.Methods：The AA models were built by injected Freund’s complete adjuvant in right and hind foot of rats.After molding 21th，Giving the medication.To detect the content of VEGF andMMP-3 in Synovial of RA Rats by Immunohistochemistry method.Results：VEGF and MMP-3 in each treatment group was significantly lower than the model group（P＜0.05）.Conclusion：It，s mechanism that may inhibit the VEGF and MMP-3 of Synovial of RA Rats.

Toddaliae Asiaticae；VEGF；MMP-3

R285.6

B

1004-2814（2014）12-1079-02

2014-07-18

国家自科基金（81360672），湖北省医学领军人才培养工程专项经费资助

袁 林