响应面法优化蓝刺头多糖除蛋白工艺的研究

杨 斌，杨 英，王雪飞，胡彦卿，范琳琳，刘丹丹，朱 浩

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018）

蓝刺头（Echinops latifolius Tausch）为菊科蓝刺头属植物。其根和头状花序入药，味苦、性寒、归胃经，具有清热解毒、排脓止血、消痈下乳、接骨疗伤的功效，用于治疗诸疮痈肿、乳汁不通、骨折等症[1]。现代研究发现，蓝刺头具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、杀虫、保肝等功效[2-5]，蓝刺头多糖是其主要活性成分之一。近年来，多糖所具有的各种生理功能逐渐被人们所重视，如降低血糖浓度、抗肿瘤、抗疲劳及抗衰老等。从天然动植物提取的多糖，往往含有大量蛋白质，蛋白质的存在不仅可能影响其结构和生物活性，且可能导致药理作用下降，因此，脱蛋白是一个重要的环节。常见的脱蛋白方法有三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法等[6]，不同的除蛋白方法适用于不同来源的多糖，目前尚未见到去除蓝刺头多糖中蛋白质方法的研究报道。本实验通过对以上3种方法的比较，对蓝刺头多糖中蛋白质最佳去除方法进行了探讨，以清洁、条件温和、操作简单的方法为多糖类药品和保健产品的开发提供了有利条件。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蓝刺头 采摘自内蒙古鄂尔多斯市，植物鉴定由内蒙古农业大学中兽医教研室完成；木瓜蛋白酶，牛血清白蛋白 Sigma；考马斯蓝G-250（Amresco），葡萄糖、三氯乙酸、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、浓硫酸等 均为分析纯。

Synergy H4型全功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；KQ-500VDB型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；RE-52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的提取工艺流程 蓝刺头用蒸馏水洗净，置于70℃烘箱烘干，粉碎，过40目筛，加30倍蒸馏水超声提取20min，超声功率为360W，温度为30℃，药液过滤，3000r/min离心10min，取上清液，得多糖溶液。

1.2.2 多糖含量的测定 以葡萄糖为标准曲线，采用苯酚-硫酸法进行测定[7]。多糖保留率（%）=脱蛋白后多糖的含量/脱蛋白前多糖的含量×100。

1.2.3 蛋白质含量的测定 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法进行[8]测定。蛋白去除率（%）=（脱蛋白前蛋白的含量-脱蛋白后蛋白的含量）/脱蛋白前蛋白的含量×100。

1.3 脱蛋白方法

1.3.1 TCA法[9]首先于每只具塞试管中加入5mL多糖提取液，再分别加入1、2、3、4、5mL 3mol·L-1的三氯乙酸溶液，混匀后4℃静置过夜，离心弃去沉淀，测定上清液中蛋白和多糖的浓度。

1.3.2 Sevage法[10]取50mL多糖提取液，按照多糖提取液、氯仿、正丁醇的体积比为16∶4∶1加入氯仿与正丁醇，溶液剧烈振荡30min后静置，待液体分层后分离出上清液，重复多次上述步骤，每次测定上清液中蛋白和多糖浓度。

1.3.2.1 木瓜蛋白酶法[11]取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），温度为60℃，酶解2.5h，反应结束后沸水浴10min，冷却至室温，3000r/min离心10min除去沉淀，测定上清液中蛋白和多糖浓度。

1.3.3 木瓜蛋白酶法除蛋白单因素实验[11]

1.3.3.1 酶解温度对蛋白去除率的影响 分别取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），调节pH为5.0，酶解时间为1.5h，酶解温度分别为50、55、60、65、70℃，反应结束后沸水浴10min，冷却至室温，3000r/min离心10min除去沉淀，测定上清液中蛋白浓度。

1.3.3.2 酶解时间对蛋白去除率的影响 分别取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），调节pH为5.0，酶解温度为60℃，酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，反应结束后沸水浴10min，冷却至室温，3000r/min离心10min除去沉淀，测定上清液中蛋白浓度。

1.3.3.3 酶解pH对蛋白去除率的影响 分别取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液，调节pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，60℃水浴酶解2h，反应结束后沸水浴10min，冷却至室温，3000r/min离心10min除去沉淀，测定上清液中蛋白浓度。

1.3.4 酶解的响应面优化方案 在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选择A（温度）、B（时间）、C（pH）为影响因素，设计三因素三水平的响应面分析方案（见表1），进行除蛋白工艺参数的优化。

表1 响应面因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 结果与分析

2.1 TCA法除蛋白结果

TCA是酸性物质，能使蛋白质带正电荷，并与负离子结合成不溶性的盐类。TCA法除蛋白结果见图1。由图1可知，蛋白清除率随着TCA加入量的增加，从45.13%增加到48.76%，同时多糖结构的破坏程度也相应的增加，导致多糖的损失逐渐增大，多糖保留率从61.05%减少到37.38%。

图1 TCA法脱蛋白效果Fig.1 The effect of removal with the TCA

2.2 Sevage法除蛋白结果

Sevage法是利用有机溶剂能够使溶液中的蛋白质变性沉淀的性质分离清除蛋白质。Sevage法除蛋白结果见图2。由图2可知，随着脱蛋白次数的增加蛋白清除率也相应的升高，Sevage法脱蛋白3次时蛋白清除率为47.47%，此后随着脱除次数的增加，蛋白清除率基本保持稳定，而多糖随脱除次数的增加损失逐步加大，多糖保留率从75.41%减少到58.57%。

图2 Sevage法脱蛋白效果Fig.2 The effect of removal with the Sevage

2.3 三种脱蛋白方法比较

将三种脱蛋白方法进行综合比较，由表2可知，酶法蛋白清除率（56.57%）高于TCA法（45.13%）与Sevage法（47.47%），其多糖保留率（98.16%）亦远远高于其他两种方法（TCA法61.05%，Sevage法67.65%），同时三氯乙酸酸性较强，可能引起多糖降解，Sevage法过程操作繁琐，酶法的反应条件温和，操作简便，综合分析三种除蛋白方法，确定使用酶法对蓝刺头多糖中蛋白质进行脱除，并使用响应面法对其除蛋白工艺进行优化。

表2 三种脱蛋白方法效果比较（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effect of three methods（±s，n=3）

表2 三种脱蛋白方法效果比较（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effect of three methods（±s，n=3）

指标 TCA法 Sevage法 木瓜蛋白酶法蛋白脱除次数 1 3 1蛋白清除率（%） 45.13±0.09 47.47±0.13 56.57±0.12多糖保留率（%） 61.05±0.11 67.65±0.13 98.16±0.06

2.4 酶法除蛋白单因素实验结果

2.4.1 pH对蛋白去除率的影响 随着多糖溶液的pH不同，酶对蛋白的清除率也相应的产生变化，由图3可知，pH为5时蛋白的清除率最大，说明该酶的最适反应pH为5.0左右，所以选择pH4、5、6作为响应面实验的中心值。

图3 pH对蛋白清除率的影响Fig.3 Effect of pH on protein removal efficiency

图4 酶解时间对蛋白清除率的影响Fig.4 Effect of time on protein removal efficiency

2.4.2 酶解时间对蛋白去除率的影响 由图4可知，随着酶解时间的延长蛋白清除率也在逐步增大，但1.5h之后蛋白清除率没有随着酶解时间的延长而增大，说明反应的最适时间为1.5h左右，所以选择时间1、1.5、2h作为响应面实验的中心值。

2.4.3 酶解温度对蛋白去除率的影响 由图5可知，随着酶解温度的升高，蛋白的清除率先升高后下降，温度超过65℃后，蛋白的清除率开始明显的下降，说明该酶的最适反应温度在65℃左右，所以选择温度60、65、70℃作为响应面实验的中心值。

2.4.4 响应面结果与分析 响应面优化方案与结果见表3。实验数据采用Design expert V8.0.6软件进行多元回归分析，得出实验因素对响应值影响的回归方程为：

表3 响应面分析方案与结果Table 3 Program and experimental results of response surface methodology

对回归模型进行方差分析可知（表4），该模型回归显著（p＜0.0001），失拟项（p=0.0897＞0.05）不显著，并且该模型决定系数R2=98.53%，表明自变量与响应值之间的模型关系显著，该模型能够解释98.53%响应值的变化，说明回归方程与实际情况拟合良好，可以用此模型来分析和预测酶法去除蓝刺头多糖中蛋白的结果。F值可以反映出各因素对实验指标影响的重要性，由F值得到因素贡献率为：C＞B＞A，即pH＞时间＞温度，其中pH和时间对方程影响极显著，温度的影响为显著。对模型各项进行方差分析可知，模型中一次项A（温度）对蛋白清除率的影响为显著（p＜0.05），一次项B（时间）、C（pH），交互项AB、AC、BC、A2、B2、C2各项对蛋白清除率的影响均为极显著（p＜0.01）。

表4 回归模型的方差分析结果Table 4 Variance analysis of mathematical regression model

图6 温度与时间对蛋白脱除率的影响Fig.6 Effect of temperature and time on protein removal efficiency

三个因素交互作用对蛋白清除率影响的响应曲面的分析结果见图6～图8。其中等高线的形状可直观的反映出交互效应的强弱，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著。图6表示pH为0水平，即pH为5时，反应时间和温度对蛋白清除率的影响。由图6可知，当固定温度不变时，随着反应时间的延长，蛋白清除率逐步增加，反应2h左右蛋白清除率达到比较平稳的阶段，变化不再明显。当固定时间不变的情况下，蛋白清除率呈现先增大后减小的趋势。两者之间的影响可以通过等高线看出。等高线呈椭圆，说明两者相互作用对蛋白脱除率的影响显著，且时间在2h、温度在65℃左右蛋白清除率有最大值。

图7表示当固定酶解时间在0水平，即时间为1.5h，反应体系的pH和温度对蛋白清除率的影响。由图7可以看出，当固定pH不变的情况下，随着温度的升高蛋白清楚率逐渐增大，65℃左右达到最大值后趋向平稳。当固定温度不变时，随着pH的增加，蛋白清除率先增大后减小，在5.5左右达到最大值。由等高线可以看出pH和温度交互作用对蛋白清除率的影响显著，蛋白清除率的最大值出现在pH5.5温度65℃左右。

图7 温度与pH对蛋白脱除率的影响Fig.7 Effect of temperature and pH on protein removal efficiency

图8表示当固定反应的温度在0水平，即温度65℃，反应的pH和时间对蛋白清除率的影响。由图8可知，当固定反应的pH不变的情况下，随着反应时间的增加，蛋白清除率逐渐增大，2h左右达到最大值，之后曲面趋向平缓。当固定反应时间不变时，随着pH的增大，在5.5左右蛋白清除率达到最大值，之后趋向平缓。由等高线可知，pH和时间两因素的交互作用对蛋白清除率的影响显著，蛋白清除率的最大值出现在pH5.5、时间2h左右。

图8 时间与pH对蛋白清除率的影响Fig.8 Effect of time and pH on protein removal efficiency

通过数据分析得到蓝刺头多糖除蛋白的最佳工艺参数为温度63.69℃，时间2.64h，pH5.84，得出最大蛋白清除率为56.82%，多糖保留率为98.12%，效果良好。

2.5 最佳工艺验证

实际应用中对酶法除蛋白的最佳工艺参数进行适当的调整，之后对同一批多糖提取液进行验证实验（n=3），蛋白去除率为56.57%±0.03%，接近于理论去除率56.82%，说明该提取工艺是可操作性强，结果稳定可靠。

表5 验证实验结果Table 5 Result of process verification

3 结论与讨论

Sevage法除蛋白过程复杂，需要多次重复，虽然三氯乙酸法操作相对简单，但这两种方法的的多糖损失率均较高，同时在反应过程中使用了大量的有机试剂，势必会造成有机物的残留。木瓜蛋白酶法与TCA法和Sevage法比较其反应条件温和，且不引入有机试剂，蛋白清除率和多糖保留率均较高，因而能够较好应用于后续科研及实际生产中。本实验中根据单因素实验结果，以反应温度、时间、pH为因素，蛋白清除率为响应值，利用响应面法对木瓜蛋白酶去除蓝刺头多糖中蛋白质的方法进行优化，结合实际应用情况得到最佳反应条件为温度：64℃，时间2.6h，pH为6.0，此条件下的蛋白清除率为56.57%，多糖的保留率为98.16%。综合比较三种方法，木瓜蛋白酶法更适用于蓝刺头多糖中蛋白质的去除，此法条件温和、操作简单，为蓝刺头多糖的进一步研究奠定了基础。

[1]王宏伟，杨婷，董玉.蓝刺头的研究进展[J].疾病监测与控制杂志，2011，5（12）：734-735.

[2]Lin C C，Yen M H，Chiu H F，et al.The pharmacological and pathological studies on Taiwan folk medicine（Ⅳ）：The effects of Echinops grijisii and Elatifolius[J].The American Journal of Chinese Medicine，1990，18：113-120.

[3]黄华，杨巧丽，王雪，等.新疆蓝刺头抗肿瘤活性部位的初筛研究[J].中草药，2009，40（S1）：232-234.

[4]金文荣.华东蓝刺头化学成分及其生物活性研究[D].杭州：浙江大学，2008.

[5]汪毅，李铣，张鹏.禹州漏芦化学成分及药理活性的研究进展[J].中草药，2005，36（2）：309-311.

[6]杨国力，王文侠，张慧君，等.玉米麸皮水溶性多糖除蛋白条件研究[J].食品工业科技，2012，33（21）：239-245.

[7]欧文，黄榕彬，曹轩，等.荠菜多糖提取液的除蛋白工艺研究[J].化工技术与开发，2012，41（11）：7-10.

[8]张岩，马丽娜，王鹏，等.苦豆子多糖脱蛋白工艺比较[J].中国新药杂志，2012，21（8）：921-925.

[9]侯小涛，赵超超，邓家刚.甘蔗叶多糖除蛋白工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（20）：240-247.

[10]郝博慧，杨鑫，马莺.蕨麻Sevage法脱蛋白工艺研究[J].食品工业科技，2011，32（2）：254-258.

[11]李圆圆，王洪新，殷飞，等.响应面优化酶法提取茶渣蛋白的工艺研究[J].食品工业科技，2013，34（7）：247-251.