结核病DNA疫苗的研究进展

张晓燕，余 琦，白雪娟，梁 艳，李 宁※(综述)，吴雪琼(审校)

(1.中国人民解放军第三○九医院病理科,北京 100091; 2.郑州金域临床检验中心，郑州 450000)

全世界约20亿人口感染结核分枝杆菌，每年结核病新增病例870万，将近140万人死于此病[1]。随着耐多药结核病、广泛耐药结核病和人类免疫缺陷病毒感染患者的逐渐增多，结核病控制形势越来越严峻[2]。从1923年开始，卡介苗就已经加入世界卫生组织扩大免疫计划之中，至今卡介苗的接种量超过30亿剂，并且每年有将近1亿的新生儿仍在接种此疫苗，这使其成为临床应用最为广泛的结核疫苗，也是目前唯一可用于人类预防结核病的疫苗[3]。卡介苗可以有效预防新生儿及儿童严重的结核病(如结核性脑膜炎和粟粒性结核)，但对于成人肺结核疾病的预防效果非常弱，其免疫保护效率为0%～80%[4-7]。因此，研发新型的结核疫苗以替代或加强卡介苗势在必行。

1 DNA疫苗的优点

DNA疫苗是一种最常见的基因疫苗，将含编码某种外源蛋白基因的质粒DNA直接导入动物组织机体内，外源基因于体细胞中表达，其表达产物为病原体的有效抗原成分，可刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞，分别介导体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗作为第三代疫苗，与第一代疫苗(减毒、灭活疫苗)及第二代疫苗(亚单位疫苗)相比，具有以下优势[8]：制备简便，成本低廉；稳定性及安全性更好；可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将不同的抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；可持续诱导体液及细胞免疫应答；预防和治疗作用兼顾。

2 结核病DNA疫苗

1994年英国Lowrie等[9]首先报道将编码麻风分枝杆菌热激蛋白 (heat shock proteins,HSP)65基因的重组质粒DNA肌内注射免疫小鼠，然后用结核分枝杆菌攻击，结果细胞免疫功能显著增强，肝脏菌落形成单位显著减少，表明DNA疫苗与常规卡介苗有相似的保护作用。从此，DNA疫苗成为防治结核病研究的新热点。

1998年随着英国Sanger中心和法国Paeteur研究所科学家对结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作的圆满完成，为寻找结核DNA疫苗的研究提供了极好的机遇[10-11]。结核分枝杆菌全基因组序列由4 411 529 bp组成，包括4411个基因，具有潜在编码能力的基因约有3977个，约占90.2%。结核DNA疫苗所插入的目的基因应选择具有免疫保护性的抗原序列，从中筛选保护力强的作为候选基因。在这二十几年中，有许多结核病DNA疫苗在动物实验中获得了较理想的效果，主要包括Ag85复合物、6×103早期分泌性抗原靶(6×103Da early secretory antigenic target,ESAT6)、结核分枝杆菌分泌蛋白64(mycobacterium tuberculosis secreted proteins 64,MPT64)、HSP65、HSP70等。也有一些新型的结核病DNA疫苗取得了一定的成果。

2.1传统的结核病DNA疫苗

2.1.1Ag85复合物 Ag85复合物是结核分枝杆菌和卡介苗中的主要分泌性蛋白，在结核分枝杆菌H37Rv株中占分泌蛋白总量的30%，是一组重要的分枝杆菌分泌蛋白。Ag85复合物是由Ag85A、Ag85B、Ag85C三个亚单位组成，有研究表明Ag85A和Ag85B的可诱导较强的Th1免疫反应，干扰素γ、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α显著升高，而Ag85C却无此效应[8]。Ag85A是一种纤维连接蛋白，相对分子质量是32×103，三者中分泌量较高。Wang等[12]在研究动物实验中表明，Ag85A DNA疫苗能诱导强烈的免疫反应：Th1型细胞因子(干扰素γ和白细胞介素2)的显著分泌，并且在调节大量免疫细胞激活及诱导细胞毒性细胞在清除病毒或者细菌中发挥重要的作用，本实验室用生理盐水、空载体组、微卡菌苗、Ag85A DNA疫苗分别肌内注射免疫小鼠，酶联免疫吸附测定法测定产生的干扰素γ高于其他组，白细胞介素4最低。Liang等[13]通过构建多重耐药结核病菌株的小鼠模型，用不同组疫苗治疗，最后单独使用Ag85A DNA疫苗组与利福平或吡嗪酰胺联合治疗组降低了肺、脾的细菌载量，表明Ag85A DNA疫苗对多重耐药结核病菌株也有一定的治疗作用。

Ag85B抗原具有较高的免疫原性，免疫接种Ag85B抗原，可以保护小鼠和豚鼠避免结核分枝杆菌引起的相关炎性反应[14]。用Ag85B DNA疫苗免疫小鼠，结果显示由CD4+T细胞产生的干扰素γ显著增高，并且控制了巨噬细胞内的结核分枝杆菌的增长，对感染结核分枝杆菌的小鼠起到了保护性作用[15]。

2.1.2ESAT-6、MPT64 ESAT6和MPT64都是结核分枝杆菌早期分泌滤液蛋白中的主要成分，也是重要的T细胞抗原。Kamath等[16]将MPT64、Ag85B和ESAT-6这3种分泌性抗原基因分别导入pJW4303载体中，构建成pJI23(DNA-64)、pJI30(DNA-85B)和pJIE6(DNA-E6)重组质粒，并且以PBS、pJW4303载体和卡介苗作为对照组，分别肌内注射免疫C57BL/6J鼠3次，每3周1次，MPT64、Ag85B DNA疫苗组的小鼠脾淋巴细胞明显增殖并产生高水平干扰素γ，但不产生白细胞介素4，随后第3次免疫小鼠后4周用结核分枝杆菌气雾攻击后，小鼠肺菌落计数显示，Ag85B DNA疫苗的保护力最强，其次为ESAT6 DNA疫苗，MPT64 DNA疫苗次之，但三者均比卡介苗的保护力差。吴雪琼等[17]用生理盐水(A)、载体JW4303质粒(B)和卡介苗(C)为对照，MPT64 DNA疫苗组(D)和ESAT6 DNA(E)疫苗组免疫小鼠，最后1次DNA免疫后3周腹腔内注射结核分枝杆菌H37Rv株菌悬液，结核分枝杆菌攻击5周后，B、C、D和E组脾菌落数均显著少于A组；结核分枝杆菌攻击10周后，从肺菌落数由低到高依次是C

2.1.3HSP65、HSP70 HSP65、HSP70都属于HSP家族，在结构上都是高度保守的蛋白质，并且在结核分枝杆菌感染过程中，是机体对抗其入侵的重要的免疫保护性抗原，它们既能增强机体的免疫应答，又保持了分枝杆菌抗原特性与免疫佐剂的作用，并且还具有分子伴侣的作用，可协助表达蛋白质的折叠，在结核分枝杆菌感染的后期发挥作用。Lowrie等[9]最先报道以麻风分枝杆菌HSP65质粒DNA免疫小鼠，然后用结核分枝杆菌或卡介苗攻击，结果显示，HSP65质粒DNA能显著增强细胞免疫功能，肝脏菌落计数显著减少。Lowrie等[18]首次将HSP65、HSP70 DNA疫苗用于治疗BALB/c小鼠结核病模型中，实验以生理盐水、空质粒载体和卡介苗为对照组，用pcDNA3.0-HSP65和pcDNA3.0-HSP70重组质粒免疫小鼠，HSP65、HSP70 DNA疫苗诱导产生的γ干扰素水平显著高于对照组，产生的白细胞介素4也显著低于其他各组(P<0.05)；从小鼠的脾、肺菌落计数来看HSP65 DNA疫苗组最低，HSP70 DNA疫苗次之，先将结核小鼠经化疗12周后做菌落计数，再用生理盐水、空载体质粒、HSP65 DNA疫苗间隔2周免疫小鼠3次，第24周用地塞米松治疗1次，8周后再做菌落计数，结果显示，HSP65 DNA疫苗可使小鼠结核病化疗后脾和肺内残余的菌数显著减少。Silva等[19]用HSP65 DNA疫苗结合化疗药物治疗BALB/c小鼠结核病，1个月就可显著减少肺和脾结核分枝杆菌载量，6个月后肺中未检测到结核分枝杆菌；同时还发现HSP65联合化疗药物治疗对结核分枝杆菌敏感株H37Rv和耐药株同样有效。

2.2新型的结核病DNA疫苗

2.2.1Rv3407 结核分枝杆菌RV3407基因由300 bp组成，编码一个由99个氨基酸组成的蛋白质，分子质量为11.0096×103。Rv3407蛋白是结核分枝杆菌在生长过程中分泌到细胞外的分泌蛋白，主要在结核分枝杆菌休眠期表达，是一种潜伏相关抗原，此抗原受两种复苏促进因子的调控[20]。Schuck等[21]研究35个结核潜伏期相关抗原和ESAT6/培养滤液蛋白融合抗原、纯蛋白衍生物刺激活动性肺结核患者和结核潜伏感染者T淋巴细胞产生的免疫反应和细胞因子，结果显示，其中7种结核潜伏期相关抗原(Rv3407、Rv1733c、Rv2003、Rv2005c、Rv0140、Rv1009和Rv2450c)能刺激T淋巴细胞产生较强的反应，尤其是Rv3407特异的T淋巴细胞反应在结核潜伏感染患者中可广泛检出，而在活动性肺结核患者中未检出，在个体中检测Rv3407特异的T淋巴细胞干扰素γ反应可有效地鉴别结核病患者和结核潜伏感染者，其一致率达83%。

Mollenkopf等[22]对结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗菌株的蛋白质采用比较蛋白质组学技术进行分析，从而挑选表达不同的蛋白质基因作为候选的DNA疫苗(至少60个蛋白在两菌株中表达不同[23])，鉴定了其中36个基因作为候选的结核分枝杆菌DNA疫苗，通过应用气溶胶法制备的小鼠结核模型进一步研究其保护效力，结果发现候选者Rv3407 DNA疫苗具有强而的免疫保护效力，可诱导小鼠产生高水平的干扰素γ。此外，通过卡介苗初免、Rv3407 DNA疫苗加强的异源性初免加强策略，其产生的抗结核感染的免疫保护效力优于卡介苗单独免疫。

刘蓉娜等[24]以基因重组卡介苗AERAS-422基因组为模板，通过聚合酶链反应扩增获得长300 bp的Rv3407基因片段，成功地构建了真核表达质粒pVAX1-Rv3407，转染293T细胞48 h后，采用免疫荧光法及蛋白质印迹法检测到Rv3407蛋白在293T细胞中有表达，表明该质粒可通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原。Rv3407 DNA疫苗能诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，为新型结核疫苗的研制奠定了基础。

2.2.2Rv1733c Rv1733c是结核分枝杆菌在休眠期表达量比较高的一种保守的跨膜蛋白[25]。Gillian等[26]在南非、冈比亚和乌干达这三个结核高负担国家中研究7个经典的结核分枝杆菌重组蛋白抗原和51个休眠调节子编码的结核分枝杆菌重组蛋白抗原刺激人机体产生的免疫应答情况，发现Rv1733c抗原是这三种人群中被识别频率最高的一个潜伏相关蛋白抗原，并且应用酶联免疫吸附试验检测全血中分泌的干扰素γ量也较高。Bivas-Benita等[27]用PLGA-PEI np载入pV1J.ns-tPA质粒载体中与Rv1733c连接，构建了Rv1733c DNA疫苗，每间隔3周肌内注射免疫BALB/c小鼠1次，共3次，第3次免疫后3周，再用Rv1733c蛋白加不完全弗氏佐剂进行加强免疫一次，结果显示，Rv1733c DNA疫苗组的脾淋巴细胞增殖显著高于空载体组，干扰素γ水平也显著增加；并且在最后用蛋白加强免疫后脾淋巴细胞的增殖和干扰素γ分泌都显著增强。Roupie等[28]将8个休眠调节子基因编码的结核分枝杆菌抗原(Rv1733c、Rv1738、Rv2029c、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c和Rv2628)与DNA载体pV1J.ns-tPA连接，分别肌内注射免疫BALB/c和C57BL/6J小鼠，用酶联免疫吸附试验检测Rv1733c DNA疫苗组小鼠血清中可产生较高水平的免疫球蛋白G抗体，但脾淋巴细胞培养上清中分泌的Th1型细胞因子干扰素γ和白细胞介素2较少。Rv1733c DNA疫苗能诱导宿主产生较强的体液免疫应答，而Th1型细胞免疫应答的结果尚不一致，是否可作为新型结核疫苗的侯选者尚需进一步研究。

2.2.3Rv3872 RD1(region of difference-1)区基因仅存在于致病性结核分枝杆菌基因组中，而在卡介菌中缺失。RD1区全长9.5 kb，有9个开放读码框(Rv3871～Rv3879c)，共编码9个蛋白质，其中Rv3872编码蛋白为PE35，是PE蛋白家族成员之一。PE蛋白质家族是一个富含甘氨酸的蛋白质家族，该家族蛋白质在结核抗原变异中扮演着非常重要的角色。Hanif等[29]将PE35基因克隆到DNA疫苗载体pUMVC6中，构建成pUMVC6-PE35重组质粒，肌内注射BALB/c小鼠，3周后最后一次免疫接种，将小鼠处死，进行脾淋巴细胞培养，结果显示，PE35 DNA疫苗组的脾淋巴细胞显著增殖，并且分泌大量Th1型细胞因子干扰素γ，而Th2型细胞因子白细胞介素5和抗炎细胞因子白细胞介素10未检测到，此外，他们又合成6个不同的PE35多肽(P1-P6)，对PE35 T细胞表位进行了预测，结果显示，多肽P1、P3、P4和P5均可刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖，其中多肽P4(VSAQAATAFTSEGIQLLASNAQD)脾淋巴细胞增殖最显著；多肽P1、P3和P6可刺激小鼠脾淋巴细胞产生干扰素γ，其中多肽P6(GEAVQDVARTYSQIDDGAAGVFAE)产生的干扰素γ最多；所有多肽刺激小鼠脾淋巴细胞均未检测到白细胞介素5和白细胞介素10的分泌。这些结果表明，PE35 DNA疫苗主要诱导 Th1型免疫，PE35不同的抗原表位可诱导产生不同强度的T细胞反应，PE35 DNA疫苗可能作为一种新的结核病候选疫苗。

3 小 结

随着耐多药结核病及广泛耐药结核病患者逐渐增多，再加上高病死率的人类免疫缺陷病毒感染，因此选择一种有效地控制和预防结核病发生的具有安全、经济、高效的结核疫苗就显得至关重要。虽然结核DNA疫苗以其无比的优势已成为研究热点，包括多价的DNA疫苗、卡介苗初免DNA疫苗加强免疫、DNA疫苗与细胞因子联合免疫等，但其仍存在一些不可避免的问题，如抗原基因的选择、载体的构建、免疫途径和免疫程序的选择、免疫佐剂的使用、安全性、免疫耐受性等。随着对结核杆菌致病的免疫机制的进一步研究和阐述，基因组学和蛋白质组学研究的深入，相信这些问题都将解决，DNA疫苗会以其他疫苗无可比拟的优势给结核患者带来希望。

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