绵羊诺维梭菌病的实验室诊断及病因分析

肖开提·阿不都克力木，热依汗古丽·阿不都热依木，斯马依·依斯拉木

（1.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐830063；2.塔什库尔干县畜牧兽医站，新疆 塔什库尔干县845250）

羊诺维梭菌病又称羊黑疫或水肿梭菌病，是由B型诺维梭菌引起的绵羊、山羊的一种急性高度致死性毒血症。本病以肝实质发生坏死性病灶为特征。诺维梭菌分为A、B、C 3型。A型菌能产生α、γ、ε、δ4种外毒素；B型菌产生ε、β、η、ζ、θ5种外毒素；C型菌不产生外毒素，此型菌与脊髓炎有关，但无病原学意义。

1 发病情况、临床症状及治疗情况

2012年10月中旬起，新疆和丰县发生以成年羊只早晨已死于圈内，个别羊只开始卧地不起并在1 h内死亡的病例，部分病例可拖延1 d～2 d，病羊放牧时掉群，食欲废绝，精神沉郁，反刍停止，呼吸急促，体温41.5℃，臌气死亡，虽然当地兽医也开展了一些治疗，但毫无效果，至10月底送病料到本实验室期间先后有200多只羊死亡。

2 诊断方法

2.1 剖检及病理变化 病羊尸体皮下静脉显著淤血，使羊皮呈暗黑色外观，胸部皮下组织水肿，胸腔、腹腔和心包有大量透明黄色液体，遇空气后凝固，真胃幽门部、小肠黏膜充血、出血。肝肿胀，肝脏表面和深层有数目不等的凝固性坏死灶，呈灰白色不整圆形，周围有一鲜红色充血带围绕，坏死灶直径可达2～3 cm，切面呈半月形。心内膜常见有出血点。

2.2 形态与染色镜检 无菌分别取心、肝、脾、肺、肾、淋巴结及小肠等脏器组织涂片，进行革兰染色，并逐一镜检。取肝脏有坏死灶的部分涂片加载玻片即用直接涂片法镜检。记录镜检结果。

2.3 细菌分离培养 无菌操作，取镜检结果有明显细菌感染的小肠、肝、脾，分别接种于普通肉汤培养基、厌气肉肝汤培养基中（加热80℃15min～20min）[3-4]，进行增菌培养。经37℃24 h培养，厌气肝汤产气，肉汤混蚀，液面有菌膜。取厌气肉肝汤培养物接种于NP鲜血培养基[3-4]，经二氧化碳培养法42℃48 h厌氧培养，可见β溶血环，取一溶血菌落接种于厌气肉肝汤培养基进一步进行纯培养。取普通肉汤培养物分别接种于普通琼脂培养基中和绵羊鲜血培养基进行需氧分离培养，经37℃24 h培养物中长有红色菌落和不溶血的白色透明菌落，挑取两株菌落分别接种于两个普通肉汤培养基进行纯培养。

2.4 动物试验 普通肉汤和厌气肉肝汤，经37℃24 h培养，涂片染色镜检，可见获得纯培养物。设4组小鼠试验组（小鼠由新疆医科大学实验动物中心提供），每两只为1组，其中两组分别经腹腔注射普通琼脂培养基中和绵羊鲜血培养基中分离到的两株肉汤培养物，每只注射0.2mL，从NP鲜血培养基中分离到的厌气肉肝汤培养物经肌肉接种于一组小鼠，每只注射0.2 mL，另设健康对照组观察。

2.5 生化鉴定试验 从NP鲜血培养基中分离到的革兰阳性厌氧菌株氧化酶试验呈阴性，将其接种于细菌自动鉴定Rapid ID A快速厌氧菌鉴定试条上37℃培养4 h。另将上述革兰阳性厌氧菌株分别接种于葡萄糖、麦芽糖、甘油、甘露醇、乳糖、蔗糖、水杨酸，进行糖发酵试验，接种于紫乳培养基，还进行靛基质，硝酸盐还原试验，明胶试验[3-4]，观察结果。

2.6 药敏试验 用需氧培养物和厌氧培养物分别进行，纸片式药敏试验。

3 结果

3.1 镜检结果 小肠、肝、脾等脏器可见革兰阳性、粗细一致、菌端钝圆、多单个、有时成双或短链，有卵圆形芽孢，位于近端，无荚膜的大杆菌和细菌形态多样，呈杆菌、长而弯曲或长丝状，无荚膜，无芽孢的革兰阴性杆菌。另在小肠还可见呈双或链状排列革兰阳性球菌和一些形状不规则的革兰氏阳性粗大杆菌。肝脏病料涂片可见双腔吸虫幼虫和棘球蚴幼虫虫体。

3.2 细菌的分离培养 绵羊鲜血培养基和普通培养基37℃培养18 h～20 h后，有凸起、光滑、湿润、乳白色、边缘整齐的中等偏大菌落和白色至浅黄色、圆形、表面光滑、边缘整齐半透明，微隆起的菌落。在麦康凯培养基上可见较大圆整或不规则，扁平或突起的深红色的湿润菌落和露滴状、帽针头大小、呈桔黄色的菌落。在NP厌氧鲜血琼脂培养基上可见灰白色、不透明、圆而隆起、边缘整齐或不规则，有β-溶血环直径在2mm～5mm的菌落和不溶血白色、表面光滑、边缘整齐、微隆起小圆形菌落。厌气肉肝汤培养产气，普通肉汤培养基呈均匀混浊液体，对两种培养物分别进行革兰染色镜检可见同样品镜检中见到的非常纯的两株菌。

3.3 动物试验 注射从NP鲜血培养基中分离到的培养物试验组的2只小鼠均在12 h内死亡，剖检可见死亡小鼠注射局部及其附近皮下有明显的非出血性胶样水肿，小肠、肝、肺、肾、脾等器官出现明显出血性病变，取肝、肺，脾组织分别进行革兰染色镜检，可见与注射培养物相同的细菌，其他两组和对照小鼠没有死亡。

3.4 生化试验 细菌自动鉴定Rapid ID A快速厌氧菌鉴定试条经37℃培养4 h，未能读取结果，后发现该试条所能鉴定的细菌中没有诺维梭菌。生化试验的结果是该菌能够发酵葡萄糖、麦芽糖、甘油；不发酵甘露醇、乳糖、蔗糖、水杨酸；紫乳培养基无任何作用，不发生发酵爆裂、不产生靛基质、硝酸盐还原试验阴性，明胶试验液化。其主要的生化试验指标结果如表1。

3.5 鉴别诊断

表1 生化试验

3.5.1 病羊尸体皮下静脉显著淤血，使羊皮呈暗黑色外观，肝肿胀，肝脏表面和深层有数目不等的凝固性坏死灶。

3.5.2 肝脏直接涂片法镜检，可见双腔吸虫和棘球蚴幼虫虫体。

3.5.3 肝脏切面涂片革兰染色镜检可见革兰阳性大杆菌，菌形态两端钝圆、可见卵圆形芽孢，无荚膜，该菌株厌氧条件要求非常苛刻，二氧化碳培养法在NP厌氧鲜血琼脂培养基上才生长并可见β溶血环；紫乳培养基无任何反应，不发生发酵爆裂。

3.5.4 而腐败梭菌肝脏压片可见长丝状菌，菌落呈弥漫性生长，紫乳发酵试验缓慢凝固；产气荚膜梭菌C型、产气荚膜梭菌D型血液、内脏涂片多无菌，菌落呈圆形光滑，紫乳发酵试验呈爆裂发酵。

3.6 药敏试验 结果痢特灵、新霉素高敏；阿米卡星、新霉素、氧哌嗪青霉素、先锋Ⅴ中敏；其他药物不敏感。

4 讨论

根据生化试验、紫乳培养基爆裂发酵试验结果及寄生虫诊断试验结果，临床症状、剖检变化，确定所分离到细菌为诺维梭菌B型菌。该病例可确诊为有双腔吸虫和棘球蚴感染肝引发炎症继发感染B型诺维梭菌病。资料显示，诺维梭菌病发生与肝片吸虫有关，而本次发现有双腔吸虫和棘球蚴感染肝引发炎症。

4.1 诺维梭菌为革兰阳性大杆菌，两端钝圆，易形成卵圆形芽孢，无荚膜，厌氧条件要求非常苛刻[1]。诺维梭菌广泛存在于自然界特别是土壤之中，羊采食被芽孢体污染的饲草后感染。当羊感染肝片吸虫时，肝片吸虫幼虫游走损害肝脏使其氧化-还原电位降低，存在于该处的诺维梭菌芽孢即获适宜的条件，迅速生长繁殖，产生毒素，进入血液循环，引起毒血症，导致急性休克而死亡[2]。

4.2 双腔吸虫在发育过程中，需要两个中间宿主。第一中间宿主为陆地蜗牛的条纹蜗牛，第二中间宿主为蚂蚁，从终末宿主粪便排出的虫卵，被陆地蜗牛吞吃后，在其体内发育成尾蚴，排出螺体外，被蚂蚁吞吃后，在其内形成囊蚴。家畜由于吃草时吞吃含囊蚴的蚂蚁而感染[5]。和丰县畜牧业主要以传统游牧为主，近年来本单位的检测结果显示，该地区家畜各类寄生虫的感染率呈明显上升趋势，故本次可能是驱虫不彻底的羊群发病。

4.3 确诊后，对所有发病羊群紧急注射羊黑疫疫苗和伊维菌素体内外驱虫药的治疗防疫措施，迅速控制疫情，羊群不再出现突然死亡的疫病。

4.4 防疫措施对本病流行的地区应控制肝片吸虫感染；常发病地区定期接种“羊快疫、肠毒血症、猝击、羔羊痢疾、黑疫五联苗”[4]。本病发生、流行时，将羊群移牧于干燥地区，可用抗诺维梭菌血清进行早期预防，必要时重复1次。病程稍缓的羊只，根据药敏试验结果来选择适当的药品进行治疗或对发病早期病羊静脉或肌肉注射抗诺维梭菌血清50mL～80mL，必要时重复用药1次。

[1]杨本升，刘玉斌，苟仕金，等.动物微生物学［M］.长春：吉林科学技术出版社，1995：629-632．

[2]中国农业科学院，哈尔滨兽医研究所.兽医微生物学［M］.北京：中国农业出版社，1998：161-170．

[3]南京农学院，山东农学院，江苏农学院等.家畜传染病诊断学［M］.上海：上海科学技术出版社，1978：281-286．

[4]费恩阁.动物传染病学［M］.长春：吉林科学技术出版社，1995：271-276．

[5]新疆维吾尔自治区畜牧厅.新疆动物疫病调查与防制［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1995：479-481．