狂犬病灭活疫苗PV2061株的免疫原性试验

张晓华，杨 琪，王庆波，张立波

（1.辽宁成大动物药业有限公司，辽宁 本溪117000；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 朝阳100125；3.中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193）

狂犬病是由狂犬病病毒(RV)引起的一种自然疫源性人畜共患传染病。RV属于弹状病毒科（rhabdoviridae）狂犬病病毒属（lyssavirus）[1]。狂犬病主要引起神经系统症状，死亡率几乎为100%。我国是狂犬病的高发区，在过去的60年间，已有12万人死于狂犬病。RV可以感染所有的温血动物，其中病犬是狂犬病病毒主要传染源。疫苗接种是预防狂犬病最主要的方法[2]。WHO建议当动物群体的狂犬病有效免疫率超过70%时，即可控制动物狂犬病的发生和流行[3-4]。WHO同时建议进行大面积犬群免疫接种时应使用灭活疫苗，因为灭活疫苗安全，不存在毒力返强的现象，而且灭活苗对温度的变化不太敏感、比活苗容易管理。

本试验使用兽用狂犬病灭活疫苗PV2061株的3种不同剂量免疫犬，随后对免疫组犬和对照组犬的血清抗体水平进行检测，并对这些犬进行保护街毒攻击试验，检测PV2061株对犬的免疫保护效果，本试验为灭活疫苗PV2061株的保护效率和应用临床提供了试验依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗、街毒及试验动物 狂犬病灭活疫苗（PV2061株）剂型注射液由辽宁成大动物药业公司生产，规格1.0mL/剂；狂犬病中和抗体阴性试验犬50只。强毒RV BD06株在脑内接种小鼠，测定小鼠LgLD50后于-80℃储存备用。

1.2 免疫接种 试验犬随机分成4组。其中试验1组：20只；试验2组：5只；试验3组：5只；对照组20只。1组1mL/剂（正常剂量）接种犬，2组0.5mL/剂接种犬，3组0.25mL/剂接种犬，4组为对照组不接种。

1.3 中和抗体检测 对免疫前、免疫后2周和4周，以及攻毒后60 d和90 d的所有试验犬进行静脉采血、分离血清，并用荧光抗体试验（FAVN）方法检测中和抗体水平。

1.4 攻毒试验 免疫后28 d对试验犬腮下咬肌接种1mL（105LgLD50/mL）RV BD06株悬液。攻毒后，将所有试验犬隔离饲养，观察90 d。对出现狂犬病典型症状或濒临死亡的犬，及时实施安乐死，取脑组织，通过直接免疫荧光（DFA）检测，确定发病或死亡原因。

1.5 RV的检测 攻毒结束时，对所有试验犬实施安乐死，采集脑组织，通过直接免疫荧光（DFA）检测狂犬病病毒是否存在，从而确定发病或死亡原因。

2 结果

2.1 血清学效力检测 对不同时期的试验犬用FAVN方法检测血清中和抗体，结果显示免疫前血清抗体全部为阴性，免疫4周后1组和2组血清抗体阳性率为100%，抗体平均滴度为4.364 IU/mL和1.484 IU/mL。3组的中和抗体滴度较低，平均滴度为0.332 IU/mL。如表1。

表1 RV抗体滴度

2.2 攻毒保护率 攻毒后90 d内观察，免疫组1和免疫组2犬均未出现狂犬病症状。25只犬全部健存，免疫保护率为100%。免疫组3在攻毒后5 d 3只出现精神沉郁、四肢无力、流涎、瘫痪等症状，12 d内陆续死亡，DFA方法检测全部阳性。对照组犬全部死亡。结果见图1。

3 讨论

图1 攻毒后存活率

1885年巴斯德将感染狂犬病在兔脑和脊髓中进行传代，然后将传代毒置于进行干燥后用生理盐水溶解成乳剂作为疫苗，这是最早的狂犬病疫苗[5]。这种疫苗对预防狂犬病有一定的效果，但该疫苗中含有活病毒，虽然毒力减弱，但仍有一定的危险[6]。近年来我国引进国外的PV毒种和生产技术，利用高密度微载体灌流式法研制成Vero细胞疫苗。试验表明该疫苗安全性良好，抗体阳转率高[7]。

本试验对国产兽用狂犬病灭活疫苗进行临床免疫试验，评价该疫苗对本动物的保护效果。实验结果表明，狂犬病灭活疫苗PV2061株1mL/剂量和0.5mL/剂量免疫的试验犬在免疫14周以后产生较高的抗体水平，在免疫后28 d达到更高水平，攻毒后两组免疫动物都获得了保护。0.25mL/剂量组产生的抗体水平较低，具有一定的保护力（40%）。这表明正常剂量（1mL/剂）和1/2剂量（0.5mL/剂）在本动物中具有良好的免疫和保护效果。本试验为灭活疫苗PV2061株的保护效率和临床应用提供了试验依据。

[1] Blaney JE，Marzi A.Antibody Quality and Protection from Lethal Ebola Virus Challenge in Nonhuman Primates Immunized with Rabies Virus Based Bivalent[J].Vaccine.PLoS Pathog，2013，9(5)：e1003389.

[2] Shim E，Hampson K，Cleaveland S，etal.Evaluating the cost-ef⁃fectiveness of rabies post-exposure prophylaxis：a case study in Tanzania[J].Vaccine，2009，27(51)：7167-7172.

[3]郑学星，杨松涛，王化磊，等.狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定[J].中国病原生物学杂志，2012，7（12）：881-884.

[4]吕元聪，谭春梅.狂犬病疫苗的发展现状[J].右江医学杂志，2009，37（6）：734-736.

[5] Ken-ichi Inoue，Youko Shoji.An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA[J].Journal of VirologicalMethods，2003，107：229-236.

[6] 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].第2版.北京：中国科学技术出版社，2009：189-214．

[7] 查力，高军，侯剑英，等.生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志，2006，19（3）：288-290.