猪传染性胸膜肺炎放线杆菌鉴定与耐药性试验

邹 丽，周 雪，徐登峰

（1.重庆市巴南区南彭街道畜牧兽医站，重庆 巴南401347；2.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌402460)

猪传染性胸膜肺炎（porcinecontagious pleuro⁃pneumonia，PCP）的病原是传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumonia，APP），由Patti⁃son在1957年首先发现，1964年Shope等和White等命名[1]。传染性胸膜肺炎是一种威胁全国养猪业的呼吸道细菌性疾病，临床上可以相对控制该病，但是在拉丁美洲和欧洲国家仍是一个棘手的问题。国内大多数省市经临床学、病原学、血清学诊断和检疫，均发现有该病发生，说明PCP在我国已广泛流行，并有扩大蔓延之势[2-4]。传染性胸膜肺炎除了引起感染猪只死亡外，还可变为慢性疾病，使生产能力下降，导致医药和疫苗的费用不断增加，造成养殖户严重的经济损失。本试验对重庆市巴南区猪场发生的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染进行初步研究，分离鉴定猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5株，获得其对抗生素的敏感性结果，为该病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 2011年5月─2012年12月，从重庆市巴南区疑似传染性胸膜肺炎的猪场采集病料86份，其中肺脏49份、关节液24份、脾脏9份和淋巴结4份。所有病死猪临床症状均表现为：高热、咳嗽、口腔和鼻腔血样分泌物，皮肤发绀，呼吸衰竭。

1.2 主要试剂 普通营养琼脂、纯化琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂平板，购自杭州天和微生物试剂有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购自AMRESCO公司；生化微量鉴定管、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；琼脂粉，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；标准金黄色葡萄球菌菌株（ATCC 25923），购自中国兽医药品监察所。

1.3 分离纯化 病料无菌接种含NAD的鲜血琼脂平板，置于5%CO2培养箱37℃培养24 h～48 h，观察菌落形态。挑取2mm～3mm大小、无色透明、露珠样并有溶血现象的菌落继续培养分纯。

1.4 镜检及培养特性观察 将分离到的疑似APP用革兰染色法染色镜检。并将纯化细菌分别接种于普通营养琼脂平板、麦康凯平板、伊红美蓝琼脂平板、鲜血平板、巧克力平板、含NAD的鲜血平板和含NAD的巧克力平板，置于5%CO2培养箱37℃培养24 h～48 h，观察菌落形态。

1.5 卫星试验 将纯培养疑似菌株接种普通营养琼脂平板，垂直划线接种金黄色葡萄球菌，同时以不接种金黄色葡萄球菌的平板做对照，置于5%CO2培养箱37℃培养箱，24 h～48 h后观察细菌生长情况。

1.6 生化鉴定 将分离到的纯培养细菌分别接种于葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、β-半乳糖苷、M.R.、V-P、硝酸盐还原、脲酶、过氧化氢酶生化鉴定管，同时各管加入5μL 1%NAD，置于5%CO2培养箱37℃培养箱，16 h～24 h内观察发酵结果。

1.7 药敏试验 鉴定为阳性的菌株接种于含NAD的琼脂平板，均匀涂布晾干后选取氨苄青霉素、链霉素、青霉素、四环素、多粘菌素B、磺胺甲基异噁唑、氟哌酸、环丙沙星、头孢噻肟、先锋霉素Ⅴ、丁胺卡那霉素、庆大霉素、强力霉素、万古霉素14种抗生素药敏纸片贴于平板上，置于5%CO237℃培养箱，24 h后观察并测量抑菌圈直径。判定标准参考杭州天和微生物试剂有限公司《药敏实验纸片法的抑菌范围解释标准》中嗜血杆菌和其他革兰阴性杆菌的药敏纸片抑菌标准。药敏纸片保存于-20℃冰箱。

1.8 动物回归试验 健康家兔8只随机分为2组，试验组皮下注射APP菌液0.2mL/只，对照组皮下注射生理盐水0.2mL/只，隔离饲养，观察家兔发病和致死情况，从病死家兔体内分离细菌鉴定。

2 结果

2.1 病原菌分离培养及镜检 24 h～48 h后在含NAD的鲜血琼脂平板长出1mm～2mm表明光滑、半透明、露珠样小菌落，经革兰染色后，疑似菌株为革兰阴性短小杆菌，无芽孢，偶见球杆状和长丝状，呈散在分布。在普通营养琼脂平板、麦康凯培养基平板、伊红美蓝琼脂平板和鲜血平板不生长，在巧克力培养基上有散在的菌落出现，在含NAD的鲜血平板生长良好，菌落针尖大小，出现β溶血。在含NAD的巧克力平板菌落较含NAD的鲜血平板大，呈光滑、灰白色菌落，但不宜观察到溶血环。

2.2 卫星试验 越靠近金黄色葡萄球菌的菌落生长越好，菌落大、数量多，离得越远菌落小而数量少，直至不生长，表明该病原菌生长依赖V因子。

2.3 生化鉴定 该病原菌能发酵葡萄糖、蔗糖、木糖、β-半乳糖苷，乳糖、M.R.、V-P，试验为阴性，脲酶、过氧化氢酶试验均为阳性。甘露醇和硝酸盐还原试验呈现轻微的不稳定性。

2.4 药敏试验结果 药敏试验结果显示该病原菌对氟哌酸、头孢噻肟、先锋霉素Ⅴ、强力霉素高度敏感；对磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、丁胺卡那霉素中度敏感；对氨苄青霉素、链霉素、青霉素、四环素、多粘菌素B、庆大霉素、万古霉素耐药。不同猪场分离到的APP对抗生素的敏感性存在差异，如BN1和BN3对环丙沙星表现为高度敏感；而其余表现为中度敏感。

表1 5株分离病原菌药敏试验 （mm）

2.5 动物回归试验结果 试验组家兔在接种APP菌液后8 h～10 h出现精神沉郁，呼吸急促，食欲减退，4只家兔在24 h～48 h内全部死亡。剖检发现病死家兔气管和支气管中血性黏液，肺部有纤维素性物质渗出。经分离鉴定，显示该致病菌为APP。对照组家兔体温、饮水和食欲正常。

3 讨论

传染性胸膜肺炎放线杆菌病发病初期，大多数猪场首先会选用抗生素治疗，但抗生素治疗对该病临床诊断和治疗增加了不小的难度。由于APP生长依赖V因子的存在，此特性给APP的实验室病原菌诊断方向选择时增加了困难。此外，采样不合理、样品污染等也是造成不宜成功APP分离的原因。基于以上原因，本研究采集临床和剖检症状疑似传染性胸膜肺炎放线杆菌病的死亡猪病料89份，而实际只分离到5株APP。

“卫星试验”证明了APP的生长需要V因子的存在，在含有NAD巧克力平板生长好于含有NAD的鲜血平板，表现为菌落更大，颜色更深，推测可能是红细胞变性时释放出一定量的V因子，增加了培养基V因子浓度，时APP生长更为旺盛。在含有NAD的鲜血平板上，APP周围出现β溶血，因为溶血素是APP最主要的独立因子之一，具有强溶血活性和细胞毒性。

抗生素大量用于治疗细菌性疾病，导致APP存在广泛的耐药性。本研究结果显示，分离到的5株APP对头孢和喹诺酮类抗生素高度敏感；而对四环素类和氨基糖苷类抗生素耐药。隋慧[5]调查了锦州猪传染性传染性胸膜肺炎的流行情况，发现从该地区分离得到的APP对四环素类和氨基糖苷类抗生素表现为中度敏感。长期不合理的使用抗生素，导致APP对抗生素敏感性降低，耐药普增大；再者地区的差异也致使APP对抗生素的敏感性有所不同。本研究对重庆市巴南区APP药物敏感性的分析，获得各个规模场的耐药谱，对临床上治疗该病具有指导性意义。

[1]Barbara E.Straw，Jeffery J，Sylvie D′Allaire，等.猪病学，赵德明，张仲秋，沈建忠，译[M].北京：中国农业大学出版社，2008：633.

[2]Tobias T J，Raymaker R J，van Nes A，etal.Outbreak of respira⁃tory distress resembling influenza caused by Actinobacillus pleuro⁃pneumoniae pigs[J].VetRec，2009，164(13)：402-403.

[3]杜宗沛，解慧梅，吴植，等．猪放线杆菌性传染性胸膜肺炎的诊治与预防[J].中国兽医杂志，2010，46（11）：78-79.

[4]余燕，马金友，王天有，等.猪接触传染性传染性胸膜肺炎的诊治[J].河南农业科学，2007，8：107-112．

[5] 隋慧.锦州地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学，2012，40（6）：3366-3367．