适合龟裂链霉菌13C代谢通量分析合成培养基的优化及应用

王龙，赵宏图，于岚，郭美锦，储炬，张嗣良

华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237

龟裂链霉菌Streptomyces rimosus是工业化生产土霉素 (Oxytetracycline，OTC)的主要生产菌株。自1950年以来，有大量报道关于龟裂链霉菌培养条件的优化[1-2]、菌株诱变[3-4]以及基因水平改造[5]等手段以显著提高其土霉素生产能力。本课题组深入研究了磷酸戊糖途径 (PPP)中zwf基因[6-8]对土霉素合成的影响，并发现当增加土霉素合成的初始复合酶体系MiniPKS的表达量时[9]，土霉素产量显著提高。但对基因改造后变化的内在机制并未详细解释，主要是由于缺乏龟裂链霉菌初级代谢和次级代谢途径之间变化的相关信息。由于龟裂链霉菌代谢网络信息的匮乏，且没有可用于标记实验的合成培养基等条件限制，目前尚未有关于龟裂链霉菌中代谢通量分析的报道。

关于龟裂链霉菌合成培养基研究的相关文献较少，主要是Zygmunt在20世纪60年代进行了初步探索[10-13]。Zygmunt认为有机氮源的添加是促进土霉素合成所必需的，并确定了以葡萄糖和天冬氨酸为碳氮源的S-3合成培养基，其土霉素产量最高达150 mg/L。由于S-3合成培养基中含有1%的天冬氨酸，在龟裂链霉菌中天冬氨酸的代谢途径尚不清楚，从而降低构建的龟裂链霉菌代谢网络的可信度。同时天冬氨酸也可作为碳源进入中心碳代谢途径，导致增加标记信息分析和代谢通量估计的复杂度。

因此本论文通过采用不同氮源对天冬氨酸进行替换，试图筛选出合适氮源，随后应用响应面方法对合成培养基各组分进行优化，以期获得适合龟裂链霉菌生长和土霉素合成并不干扰13C示踪分析中氨基酸标记信息的合成培养基。

1 材料与方法

1.1 菌种

龟裂链霉菌模式菌株M4018，由英国Strathclyde大学Iain S Hunter教授惠赠。

1.2 培养基

MS斜面培养基：豆粉2%，甘露醇2%，琼脂2%。

初始合成培养基：葡萄糖 1%，磷酸氢二铵0.02%，天冬氨酸1%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，无水氯化钙 0.03%，硫酸亚铁0.002%，硫酸锌 0.001%，pH 7.1–7.2。

天冬氨酸替换实验的设计思路：考虑到各个氨基酸的可溶性和等电点，选取谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸和尿素作为有机氮源，硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、甲酸铵、乙酸铵、硝酸钙、磷酸二氢铵、硝酸钾和硝酸钠作为无机氮源，初始pH均调节至7.1左右，均以1%的含量进行添加，其余成分保持不变。

1.3 摇瓶发酵

将–20℃保存的甘油孢子液划线于MS培养基中，分离纯化单菌落后接种于MS培养基，30℃培养5–7 d，获得成熟的孢子。收集孢子，过滤，并稀释至合适倍数进行平板计数。然后以1×106个孢子/mL接种量，接种至合成培养基中，30℃、220 r/min摇瓶发酵5 d。过程中定时取样，每个样品做3个平行。

1.4 细胞干重的测定

取一定体积发酵液，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，菌体沉淀放置于85℃烘箱中，烘干至恒重，称重。

1.5 土霉素含量的测定

取1 mL发酵液，添加9 mol/L盐酸调节pH至1.5–1.7，放置5 min，过滤后采用高效液相色谱法(HPLC) 分析[9]。

1.6 响应面试验设计

首先设计Plackett-Burman试验，考察合成培养基中各组分对土霉素效价影响的显著性；随后设计影响最显著因素的最陡爬坡实验，并根据实验结果确定中心组合设计试验的因素和水平，以确定显著性因素的最佳值。

1.7 菌体蛋白氨基酸标记信息

菌体蛋白处理和测前衍生参照文献[14]，衍生后的样品过滤后进行GC-MS测定。

GC-MS测定：GC采用HP5MX柱，起始柱温160℃，保持1 min，以20℃/min升温至310℃，保持0.5 min；进样口温度280℃；载气为高纯氦气，恒流，载气流速1.5 mL/min，分流比1∶10；进样量1 μL；MS条件为：EI电离方式，离子源温度230℃，全扫描模式，扫描质量范围180−550。

1.8 氨基酸特征碎片总同位素标记丰度 (SFL)的计算

其中n是氨基酸的碳原子数，mi是氨基酸含有i个标记原子的质量同位素丰度。

2 结果与分析

2.1 合适氮源的筛选

龟裂链霉菌M4018在12种有机氮源和9种无机氮源合成培养基中的生长以及土霉素合成如图1所示。从图中可知M4018在含有天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸和脯氨酸等有机氮源的培养基中都能生长并产素；在含有苏氨酸或者酪氨酸的培养基中生长缓慢，基本不产素；在含有硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙和磷酸二氢铵的培养基中均能良好的生长，并产生一定量的土霉素 (50−80 mg/L之间)；而在含有硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、甲酸铵和乙酸铵等常规无机氮源的培养基中均无法生长。

图1 不同氮源对M4018生长和产素的影响Fig.1 Effect of different nitrogen sources on OTC production and cell growth of S.rimosus M4018.1:HCOONH4;2:CH3COONH4;3:NH4Cl;4:(NH4)2SO4;5:NH4NO3;6:Ca(NO3)2;7:NH4H2PO4;8:NaNO3;9:KNO3;10:tyrosine;11:threonine;12:histidine;13:arginine;14:asparagine;15:urea;16:proline;17:alanine;18:lysine;19:glycine;20:glutamate;21:aspartate.

结果证实了与无机氮源相比有机氮源的添加确实有利于龟裂链霉菌的生长以及土霉素的合成，但首次发现有机氮源的添加并非是促进土霉素合成所必需的。因此考虑通过对筛选得到的硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙和磷酸二氢铵这4种无机氮源做进一步优化以获得合适的培养基。

2.2 无机氮源的进一步确定

对上述4种无机氮源进行重复摇瓶发酵验证，培养过程中每隔24 h取样1次，观察菌体生长和土霉素合成变化规律。结果表明龟裂链霉菌M4018在以磷酸二氢铵为氮源的培养基中生长较好，而在以硝酸钾和硝酸钠为氮源的培养基中土霉素产量较高，分别为75.18 mg/L和68.57 mg/L，此时二者土霉素的相对效价分别为10.83 mg/g DCW和11.68 mg/g DCW。根据实验结果，硝酸钠和硝酸钾是适合龟裂链霉菌生长和产素，由于培养基中同时含有大量的氯化钠，因此选择硝酸钾为合成培养基中的主要氮源。并添加3-吗啉丙磺酸(3-Morpholinopropanesulfonic acid，MOPS)和磷酸二氢钾作为缓冲体系。

2.3 响应面法优化无机氮源合成培养基

2.3.1 Plaekett-Burman试验设计

本实验选取培养基中的8种成分作为考察因素，以土霉素效价为评价指标，采用Design-Expert软件进行n=12的Plackett-Burman试验设计。表1显示培养基中对土霉素效价影响显著 (可信度＞95%)的3个因素为：葡萄糖、硝酸钾和氯化钠。

2.3.2 中心组合试验进一步优化

筛选获得影响土霉素合成的显著因素：葡萄糖、硝酸钾和氯化钠后，通过最陡爬坡实验获得中心组合设计的中心点。随后设计3因素3水平响应面分析实验，以土霉素效价为响应值，试验设计和结果见表2。

表1 Plackett-Burman试验设计的因子水平及效价评价Table 1 Factor levels and efficiency evaluation in Plackett-Burman design

运用SAS和Design-Expert软件对中心组合试验结果进行统计分析，得到葡萄糖 (A)、硝酸钾 (B)、氯化钠 (C)与土霉素效价 (Y)的关系，其多元二次回归方程：Y=142.75+0.69A+5.46B–2.58C+3.98AB+2.08AC+3.97BC–10.31A2–12.00B2–4.16C2。由表 3 的方差分析结果表明：该模型是极显著 (P＜0.000 1)；失拟项不显著 (P=0.135 1)；方程的决定系数R2为98.9%，AdjR2为97.8%，因此可以认为该拟合方法和建立的模型对于效价的统计分析是有效的。通过响应面优化得到最优值为葡萄糖24.2 g/L，硝酸钾3.7 g/L，氯化钠2.0 g/L。

表2 中心组合设计设计表及试验结果Table 2 Design and result of Central Composite Design experiment

表3 回归模型的方差分析Table 3 ANOVAof quadratic polynomial model

通过Design-Expert软件对中心组合试验结果进行响应面分析，葡萄糖、硝酸钾和氯化钠显著因素相互之间交互作用强，最优值均落在实验考察的区间内。

2.3.3 验证性实验

按照优化后的最佳合成培养基配方 (命名为S-4)，分5批进行摇瓶发酵验证，所得的土霉素效价平均值为145.60 mg/L，与最高预测理论值143.58 mg/L非常接近，说明所设模型与真实情况相符，回归模型可靠。此时菌体干重平均值为6.32 g/L，相比于最初的5.87 g/L，菌体干重也轻微提高7.7%。

2.4 100%的1-13C葡萄糖标记实验

为了进一步验证获得的S-4合成培养基可以用于13C示踪分析，将S-4合成培养基中的葡萄糖用100%的1-13C葡萄糖替换，接种龟裂链霉菌M4018孢子后发酵培养，在对数生长期取样分析。

如图2所示，在以100%的1-13C葡萄糖为唯一碳源的合成培养基中进行培养时，若葡萄糖仅通过糖酵解途径 (EMP)利用，会产生50%的3-13C丙酮酸；若葡萄糖仅通过ED途径利用，则会产生50%的1-13C丙酮酸；若葡萄糖仅通过PPP途径，一位标记的碳原子以13CO2形式释放，无标记丙酮酸产生。因此通过比较丙酮酸各碳原子 (Pyr1、Pyr2和Pyr3)的SFL[15-16]即可定性比较葡萄糖3大代谢途径通量的相对大小。

图2 1-13C葡萄糖在EMP、PPP和ED途径中碳原子的代谢转移Fig.2 Metabolism of the carbon atoms of 1-13C glucose via the EMP,PPP and ED pathways.

丙氨酸和缬氨酸的所有碳骨架都是来自于丙酮酸，因此丙酮酸的SFL值可从丙氨酸和缬氨酸的SEL值相应得到，Pyr1=Pyr1-2-3−Pyr2-3。从表4中计算得到Pyr1的SFL值为1.23%，与丙酮酸的天然同位素丰度1.1%非常接近，即可认为丙酮酸的一位碳并未携带标记。即通过标记实验结果表明，在龟裂链霉菌M4018中不存在ED途径。

表4 丙酮酸族氨基酸的SFL值Table4 Summed fractionallabellings(SFLs)of pyruvate-derived amino acid fragments

3 讨论

通过比较龟裂链霉菌在不同有机氮源和无机氮源的生长和产素情况，首次发现龟裂链霉菌也能在以硝酸钾为主要氮源的合成培养基上生长，在此基础上对初始无机氮源合成培养基进行响应面优化实验，得到最优的合成培养基S-4配方 (g/L)：葡萄糖24.2，硝酸钾 3.7，氯化钠 2.0，磷酸氢二钾 4.0，硫酸镁 0.5，氯化钙 0.1，磷酸氢二铵 0.4，MOPS 7，硫酸亚铁 0.02，硫酸锌 0.01。在此培养基上菌体干重最高达6.32 g/L，土霉素效价由起始的75.2 mg/L提高到145.6 mg/L，提高193.6%，土霉素产量基本接近有机氮源的发酵水平，并成功排除在13C示踪实验中额外碳源的干扰，为后续龟裂链霉菌各突变株中碳代谢途径通量的分析提供良好的理论和技术基础。

采用100%的1-13C葡萄糖标记试验，结果表明龟裂链霉菌M4018中葡萄糖是通过EMP途径和PPP途径进行代谢，而不存在ED途径。这与已经报道的天蓝色链霉菌[17]的代谢网络模型一致。即首次从代谢流组学水平证实在龟裂链霉菌中ED途径不存在。龟裂链霉菌M4018的基因组测序已经由本课题组和英国Strathclyde大学Hunter教授课题组共同完成 (尚未公开)，基因比对的结果表明，龟裂链霉菌只存有ED途径的第2步基因eda，从基因组水平上证实了该结果的可靠性。

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