极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质

钱国军，陈彩平，翟如英，邵蔚蓝，梅艳珍

1南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046

2江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212000

在酶的6大类型中，30%–35%为氧化还原酶[1]，由于氧化还原酶在催化制备手性醇、氨基酸、羟基酸方面显示出极大的优势，因此在制药、食品、精细化工、农药等领域具有重要的用途，它的应用也越来越受到人们的重视[2-6]。大约80%的氧化还原酶需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD，NADH)作为辅酶，然而NAD和NADH的价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵得多。因此，从技术经济性的角度来看，对辅酶进行再生并循环使用很有必要[7-9]。辅酶因子再生手段主要有化学法、酶法、电化学法、光化学法和基因工程法。酶法是被研究和应用最多的再生手段，通过偶联的氧化还原反应对辅酶进行再生并循环使用是一个重要策略[10-16]。

乳酸脱氢酶 (LDH)是以NADH为辅酶，将丙酮酸经过生化反应生成乳酸，同时将NADH氧化成NAD[17]。由于乳酸脱氢酶和其反应底物丙酮酸市场价格相对较便宜，性质稳定，因此很早之前Wong和Whitesides就提出用乳酸脱氢酶进行辅酶NAD的再生[18]。作为辅酶再生的工业用酶，人们期望所用的酶具有价格低廉、性质稳定、活性高等特点，极耐热性酶在制备和应用中易于满足这些要求。虽然已经在许多微生物中发现有乳酸脱氢酶，并且有些已经对它的酶学性质进行了研究[19-20]，但是目前已报道的热稳定性乳酸脱氢酶并不多。海栖热袍菌Thermotoga maritima是一种生长在55–90℃的海底火山口附近、严格厌氧的细菌[21]。海栖热袍菌产生的乳酸脱氢酶具有热稳定性好、活性高等特点，但是海栖热袍菌生长条件苛刻，且乳酸脱氢酶 (Tm-LDH)的产生量很低[22]，工业用酶需要通过基因重组表达制备。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达，并且重组酶的酶学性质也未曾报道过[23]。因此，研究Tm-LDH基因高效表达的基因工程技术及其重组酶酶学性质对于极耐热性LDH的开发利用具有重要意义。本研究采用受σ32调控的pHsh热激表达载体[24]，对海栖热袍菌的乳酸脱氢酶进行高效表达，并对其酶学性质进行了研究，为辅酶再生系统的建立和乳酸的酶法生产技术的发展奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

海栖热袍杆菌Thermotoga maritima MSB8购自美国菌种保存中心，编号为ATCC43589；大肠杆菌Escherichia coli JM109购于Promega(Wisconsin，USA)；质粒pHsh由仙奕生物科技 (南京)南京有限公司 (Shine E Biotech,Nanjing,China) 提供[24]。

1.1.2 主要试剂

限制酶T4 DNA连接酶和DNA聚合酶购自宝生物工程公司；质粒抽提试剂盒，割胶回收试剂盒购自Qiagen公司；丙酮酸钠，NADH均购自南京丁贝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基及培养条件

E.coli培养在LB培养基中，转化子的选择用含有氨苄青霉素 (10 μg/mL)的LB培养基，重组酶最高产量测定用含有氨苄青霉素(10 μg/mL)的TB培养基，配方见文献[25]。电转化用SOC培养基。T.maritima培养基的制备及T.maritima的接种与培养参考文献[26]。

1.2.2 基因操作

T.maritima基因组DNA提取，DNA的内切酶水解和连接，DNA片段的分离，感受态细胞的制备以及基因的高效电转化均参考文献[25]。质粒的制备，从琼脂糖凝胶回收DNA等操作按照Qiagen试剂盒使用指南进行。

1.2.3 乳酸脱氢酶表达载体的构建

根据已经报道的T.maritima的乳酸脱氢酶基因序列 (TM1867,Accession No.897800)，以及pHsh中的限制性酶切位点设计并合成一对引物 1和引物 2，引物 1： 5′-catgccatggctaaaata ggtatcgtaggactcg-3′，其中含有NcoⅠ酶切位点和起始密码子；引物 2：5′-ccgctcgagttaaccgc tggtgttctgg-3′(含XhoⅠ酶切位点)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用此引物，以T.maritima菌的基因组DNA为模板，PCR扩增参数为：95℃ 5 min；98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次；72℃保温10 min。PCR扩增结束后，电泳检测并将PCR目标条带割胶回收；用NcoⅠ和XhoⅠ酶切，浓缩，以适当比例与NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的载体pHsh大片段混合并连接，电转化E.coli JM109，筛选含LDH基因片段的表达质粒pHsh-ldh。

1.2.4 LDH基因的表达和重组酶的分离纯化

基因转化和诱导表达方法：将构建好的重组质粒转入E.coli JM109，挑取单菌落接入含有氨苄青霉素 (Amp)抗性的LB培养液中。30℃培养至OD600为0.6–0.8，后转入42℃水浴摇床，200 r/min热激诱导8 h，离心，收集菌体细胞。

重组酶的纯化：将离心收集的细胞用50 mmol/L的咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液 (pH 7.0)重悬，经高压细胞破碎仪破碎细胞，13 000×g离心15 min，取上清于80℃热处理1 h后，13 000×g离心15 min，离心上清液过阴离子柱(离子交换层析)，经NaCl离子梯度洗脱，完成粗酶纯化，使重组酶达到电泳均一。

1.2.5 酶活性测定

乳酸脱氢酶活性测定采用分光光度法，以丙酮酸钠和NADH为底物，测定反应体系中NADH的下降量[22]。反应体系为200 μL，内含1 mmol/L的丙酮酸钠，1 mmol/L的NADH，7.3 μg酶，50 mmol/L的咪唑邻苯二甲酸氢钾(pH 7.0)。空白对照中不加酶，补加等体积的缓冲液，85℃反应5 min后，冰浴中迅速终止反应，用分光光度计在340 nm处测定其吸收值，计算相对于空白对照的下降值[22]。

乳酸脱氢酶酶活单位定义：每分钟氧化NADH 1 μmol所需要的酶量定义为一个活性单位[22]。用NADH作标准曲线。蛋白质浓度用Brandford法测定。

1.2.6 重组酶的性质分析

重组酶的性质分析均使用热处理后，并且进一步用DEAE-Sepharose FF处理之后的纯酶。

最适反应温度的测定：在60–100℃范围内，每隔5℃分别测定酶活 (pH 7.0)。以最高酶活为100%，计算相对酶活。

最适反应pH：在pH 4.5–8.0范围内每隔0.5个pH单位测定酶活，缓冲液是50 mmol/L咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液。最高活性被设定为100%，用以计算相对活性的变化。

温度稳定性：在酶活性相对稳定的pH 7.0下，缓冲液为咪唑邻苯二甲酸氢钾，使酶在某个温度下保温不同的时间，再测定相对酶活，以70℃保存的酶样活性为100%，计算百分比，确定酶的温度稳定性。

pH稳定性：酶在pH 5.0–8.0条件下，缓冲液为咪唑邻苯二甲酸氢钾，在酶活性相对稳定的温度70℃下保温1 h后，再分别测定残留酶活性，与不保温酶的酶活相比，计算百分比，确定酶的pH稳定性。

酶的动力学参数的测定：以20 mmol/L的丙酮酸钠为母液，分别以1–20 μL不等的量加入含有2 mmol/L的NADH的终体积为200 μL酶活反应体系中，在最适反应条件下，测定酶活力。采用Eadie-Hofstee作图法，计算动力学参数。

以100 mmol/L的NADH为母液，分别以1–20 μL不等的量加入含有2 mmol/L的丙酮酸钠的终体积为200 μL酶活反应体系中，在最适反应条件下，测定酶活力。采用Eadie-Hofstee作图法，计算动力学参数。

金属离子及有机抑制剂对酶活性影响的测定：以7.3 μg酶、1 mmol/L金属离子或者有机抑制剂、1 mmol/L NADH、1 mmol/L的丙酮酸钠和50 mmol/L咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液为200 μL反应体系，在最适反应条件下测定酶活力，以标准反应体系中的酶活力作为100%，计算百分比，确定金属离子及有机试剂对酶活性的影响。测试的金属离子分别为 Mg2+、Li+、Sr2+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+，选取的有机抑制剂为SDS、Triton-X100和EDTA。

2 结果

2.1 原核表达质粒的构建

以T.maritima菌的基因组DNA为模板进行乳酸脱氢酶基因片段的PCR扩增,电泳检测结果表明,在0.96 kb附近有一条很亮的扩增带，与报道的乳酸脱氢酶基因序列大小一致，没有明显的非特异性条带，说明所选PCR扩增条件能有效扩增基因片段。将PCR产物克隆至热激载体pHsh中，构建出重组质粒。用限制性内切酶对重组质粒进行鉴定，重组质粒能被NcoⅠ和XhoⅠ双酶切得到两条分别为0.96 kb和2.3 kb的条带 (图1)。因此，初步证明目标基因已插入热激载体中。

2.2 乳酸脱氢酶基因在E.coli中的表达及纯化

用重组质粒pHsh-ldh和质粒pHsh分别转化E.coli JM109，30℃培养，后转入42℃热激诱导8 h，收集菌体细胞进行SDS-PAGE(分离胶的浓度为12%)，考马斯亮蓝染色的结果见图2。从电泳图谱上可以看出，含有重组质粒的E.coli在分子量33 kDa处有明显的蛋白表达带，酶活达到28 112 U/mL，由此可知乳酸脱氢酶基因通过热激质粒pHsh在E.coli中实现了超量表达。

图1 重组质粒pHsh-ldh酶切及PCR扩增片段鉴定Fig.1 PCR amplification of ldh and restriction analysis of recombinant plasmid.M:DNA marker;1:PCR amplification of gene;2:fragments of 2.4 kb and 0.96 kb produced after a double-enzyme digestion of pHsh-ldh;3:a 3.4 kb fragment produced after a single enzyme digestion of pHsh-ldh.

将热激诱导的菌体细胞通过高压破碎裂解，80℃热处理1 h，取上清液SDS-PAGE检测，结果表明重组酶经热处理后，酶纯度大幅度提高，基本除去大部分的杂蛋白，纯化结果见表1。由表1可知，经过热处理后，重组酶的蛋白量为34.1 mg/mL，比酶活也提高到2 674 U/mg，酶活达到91 183 U/mL。

2.3 重组酶的酶学性质

酶学性质的研究结果表明该酶的最适反应温度为95℃，90℃半衰期为2 h，95℃保温2 h后能保持约30%的活力。有趣的是该酶适应较宽广的反应温度，在65℃的反应条件下，该酶的活性达到50%(图3)，然而在这种常规温度下酶的活性能够长时间保持稳定 (图4)。

该酶的最适pH为7.0，从5.0–7.0酶活快速升高 (图5)，但是在pH 5.5–8.0之间酶的活力稳定在60%以上 (图6)。

图2 乳酸脱氢酶纯化过程的SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE analysis of Tm-LDH in purification steps.M:protein marker;1:cell-free extract of E.coli JM109/pHsh;2:cell-free extract of E.coli JM109/pHsh-ldh;3:proteins remained after a heat treatment of 1 h;4:the purified recombinant LDH protein.

表1 E.coli中重组乳酸脱氢酶的纯化Table 1 Purification of the recombinant lactate dehydrogenase from E.coli

图3 Tm-LDH的最适反应温度Fig.3 Optimum temperature for lactate dehydrogenase activity.

图4 Tm-LDH的温度稳定性Fig.4 Thermal stability of lactate dehydrogenase.The purified enzyme was pre-incubated for various time at 65 ℃ (◆),85 ℃ (■),90 ℃ (▲)and 95 ℃ (×).

图5 Tm-LDH的最适反应pHFig.5 Optimum pH for lactate dehydrogenase activity.

由表 2可知 Mg2+、Li+、Sr2+、Ca2+、Cu2+对酶的活性没有显著影响；SDS、Zn2+对酶活均有显著的抑制作用。Co2+、Mn2+、Ni2+、Triton-X100和EDTA对酶活有显著的促进作用。以丙酮酸钠和NADH为底物时，在85℃、pH 7.0条件下，其丙酮酸钠的动力学参数Km值为 1.7 mmol/L，Vmax值为 3.8×104U/mg；其NADH的动力学参数Km值为7.2 mmol/L，Vmax为 1.1×105U/mg。

表2 金属离子及抑制剂对Lactate Dehydrogenase活性的影响Table 2 Effect of metal ions and inhibitors on the activity of Lactate Dehydrogenase

3 讨论

海栖热袍菌T.maritima是一个嗜极端高温的厌氧真细菌，生长在55℃–90℃海底火山口处，是极端耐热性酶的重要来源。但是海栖热袍菌生长条件苛刻，细胞密度较低，不适合工业化生产。基因重组技术是获得重组酶高效生产的有效途径，但是绝大多数来源于极端高温菌的自然基因在E.coli中的表达水平很低。因此，构建合适的极端菌的外源基因表达系统，高效率地表达一些极端酶，一直是人们研究的热点。本研究利用pHsh表达载体实现了Tm-LDH的一步超量表达，克服了传统的海栖热袍菌中乳酸脱氢酶基因工程菌构建困难、乳酸脱氢酶表达量较低等难题。实现超量表达不仅便于获得大量纯酶从而进行酶学性质和应用技术的研究，而且为该酶的工业化生产奠定了基础。pHsh表达载体的另一个特点是可以有效地进行热激诱导表达，不需要加入IPTG等比较昂贵的化学诱导剂。

酶学性质研究表明Tm-LDH具有很强的稳定性，90℃酶活半衰期2 h。有趣的是该酶虽然最适反应条件为95℃、pH 7.0，但是它在较宽广的温度和pH范围内活性都很高。该酶在低至65℃的反应条件下活性达到最高活性的50%(相当于 1 600 U/mg蛋白)，然而在这种常规温度下酶的活性能够长时间保持稳定。脱氢酶的这种性质对于酶的应用前景尤为重要。在涉及辅酶的氧化还原反应的生物化工过程中，生产的经济效益和可持续性都要求氧化型或还原型的辅酶能够得到再生。例如，如果氧化性辅酶NAD依赖性的2,3-丁二醇脱氢酶与NADH依赖性乳酸脱氢酶联用，就可以建立辅酶再生体系，实现手性乙偶姻和乳酸的持续生产。因此，Tm-LDH适应较宽广的温度和pH范围，有利于它在反应条件方面与不同来源的NAD依赖性脱氢酶的配伍，构建成高效、稳定性的辅酶循环体系。

研究表明，利用海栖热袍菌乳酸脱氢酶的极耐热性，将重组菌细胞破碎后的上清经过80℃的热处理后，无需经过任何色谱层析系统就可获得较高纯度的重组酶，这大大地简化了重组酶的纯化步骤，同时也极大地降低了该酶的下游处理成本，为重组酶的大规模工业化提取奠定了基础。并且发现，经过热处理之后的重组酶总酶活大幅度提高，这种实验现象重复性极高，我们推测可能的原因是由于经过热处理后，某些对酶活有副作用的因子被去除了；或者是由于该酶来源于嗜热菌而重组表达是在常温下，热处理可以通过改变该酶的构象而更好地激活该酶。类似Tm-LDH热处理之后总酶活大幅度提高的实验现象，在其他极耐热性重组酶性质分析中也有相关报道，但均未给出合理解释。对这些现象的研究将有助于我们更进一步了解耐热酶的分子机制，将有利于微生物极端酶的开发和利用，更进一步的研究还在进行中。

本研究着重对该重组酶进行了高效表达，并且对该重组酶的酶学性质进行了分析和测定，并对该酶在NAD再生的工业化应用前景进行了探讨和展望；但对该酶在NAD再生体系中具体应用还处于探索阶段。我们相信，对该酶在NAD再生体系中的更进一步研究，将有利于NAD再生体系的完善及在工业化条件下的推广与应用。

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