B族G蛋白偶联受体PAC1可调控表达体系的建立

李梅，余榕捷，钟佳萍，崔泽凯，杨延旭，张华华

1 暨南大学生命科学技术学院 生物工程研究所，广东 广州 510630

2 广东医学院 医学遗传学教研室，广东 东莞 523808

B族 G蛋白偶联受体 (G-protein couple receptor, GPCR) PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽 (Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP) 的特异受体[1-2]。PAC1主要分布在中枢神经系统，周围神经系统及神经内分泌系统 (如脑，丘脑，耳蜗，视网膜，肾上腺及胰岛等)；主要介导PACAP的神经递质[3]、神经调质[4]、神经保护[5-6]、抗神经损伤[7]及调控神经再生的功能[2-8]，是开发治疗帕金森病、老年痴呆症、手足舞蹈症等神经损伤药物的首选靶受体。PAC1除了在神经组织及神经内分泌器官特异性高表达外，PAC1的高表达还被发现与某些生理病理过程密切相关。如：在神经肿瘤细胞及神经内分泌瘤细胞高表达[9]；PAC1在老年大鼠的脑部表达水平显著随龄升高[10]；PAC1在受到辐射损伤及毒素损伤的胸腺显著表达上调[11]；慢性压力导致 PAC1在脑部终纹床核的表达水平上调[12]，最新的Nature报道：恐惧导致PAC1在小鼠杏仁核表达显著上调，表明PAC1成为压力症的分子标签[13]。鉴于PAC1介导了 PACAP 的多种生物学功能且其表达水平与某些生理病理过程密切相关，因此构建PAC1可调控表达的体系对于进一步研究 PAC1介导的生物学功能的作用机制有重大的价值。

四环素表达调控系统 (Tet-on expression system) 是由Gossen等[14]建立的基因诱导表达系统，可以实现用四环素及其衍生物强力霉素(Doxycycline, Dox) 来调控目的基因的表达。在Tet-On控制表达系统中，当Dox存在时，可诱导目的基因的表达；当Dox从系统中除去后，目的基因转录关闭，可以实现目的基因的定时、定点、定量表达和关闭[15]。Tet-On系统操作方便，适于临床应用[16]，并已被广泛应用于多种疾病的基因治疗研究中[17-18]，被认为是目前理想的真核生物基因表达调控系统。本研究中的Tet-On控制表达系统由两部分组成：一个是四环素调节元件载体pTet-on advance，含有抗G418基因，表达四环素抑制子；另一个是反应质粒pTRE-PAC1-EYFP，表达目的基因PAC1-EYFP，并位于四环素操纵子控制的启动子下游。因此，利用此系统调控基因表达时，需将2个质粒转染同一个细胞中。本研究选择中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO) 细胞系CHO-K1，此细胞已被证明既不表达PACAP，也不表达PAC1[19]。此外，为了方便检测和示踪，本研究采用了PAC1的C端融合增强型黄色荧光蛋白(EYFP, enhanced yellow fluorescent protein) 的融合蛋白PAC1-EYFP。本研究拟利用Tet-On控制表达系统建立PAC1-EYFP体外可调控表达的细胞系PAC1-Tet-CHO，实现PAC1-EYFP的Dox依赖的可控表达，为PAC1生物学活性的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

含有PAC1-EYFP基因的质粒pEYFP-PAC1-EYFP为本实验保存[20]。pTet-on advanced，pTRE-tight载体购自Clontech公司。G418为Gibco BRL 产品。潮霉素 (Hygromycin) 为Roche产品。强力霉素 (Doxycycline, Dox)，MTT(Methylthiazoletetrazolium bromide) 均为Sigma产品。Lipofectamine LTX 购自美国生命技术公司(GIBCO BRL)。限制性内切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ购自美国New England Biolabs (NEB) 公司。

1.2 方法

1.2.1 pTRE-PAC1-EYFP表达载体的构建和鉴定

本研究的PAC1基因大小为1 407 bp，EYFP基因大小为750 bp，融合基因PAC1-EYFP大小为2 157 bp，通过限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对质粒pEYFP-PAC1-EYFP进行双酶切，将酶切后的PAC1-EYFP基因片段再亚克隆入 pTRE-Tight载体的EcoRⅠ和NotⅠ位点间，构建重组表达载体pTRE-PAC1-EYFP。将重组质粒转化 E. coli DH5α，针对PAC1基因编码框的1–300 bp的设计并合成鉴定引物 (F1：5′-ATGGCCAGAACC CTGCAGCTC-3′, F2：5′-AAAGCCAGAATCCCC TATGGT-3′)，用PCR对重组子进行初步鉴定，阳性克隆将扩增出对应于PAC1基因的一条300 bp的PCR产物，并通过利用位于pTRE-Tight质粒多克隆位点上游的引物进行基因测序，鉴定重组质粒pTRE-PAC1-EYFP中PAC1-EYFP基因的存在及其序列的正确性。

1.2.2 四环素调节元件载体 pTet-on advanced的转染、筛选及鉴定

用含10%胎牛血清DMEM培养基 (无抗生素)在6孔细胞培养板中培养CHO细胞，待细胞80%成片时，采用脂质体转染方法按说明书操作，将四环素调节元件载体pTet-on advanced转入CHO细胞。细胞在37 ℃、CO2孵箱中培养6–10 h后，换含5% FBS的DMEM培养液。转染48 h后，将细胞1∶5传代，待细胞贴壁后换10% FBS、800 μg/mL G418的DMEM培养液培养，用梯度稀释法筛选抗G418的细胞克隆Tet-CHO。

1.2.3 四环素反应元件载体pTRE-PAC1-EYFP和线性潮霉素基因的共转染、筛选及鉴定

同1.2.2采用脂质体转染法，将带有荧光基因的反应质粒pTRE-PAC1-EYFP和线性潮霉素基因 (the Linear Hygromycin Marker)，共转染至上述带有质粒pTet-on advanced的阳性细胞克隆Tet-CHO中，线性潮霉素基因用来标化该载体，用10% FBS、500 μg/mL潮霉素的DMEM培养液培养，梯度稀释法筛选抗潮霉素的阳性克隆PAC1-Tet-CHO。

1.2.4 Dox诱导PAC1-EYFP的表达及检测

将PAC1-Tet-CHO细胞系培养至60%–70%成片时，分别加入不同浓度强力霉素 (Dox) 诱导，Dox的终浓度分别为0、10、100、1 000 μg/mL，每个浓度做5个重复；在37 ℃、5% CO2培养箱诱导培养48 h。分别用倒置荧光显微镜IX71下观察不同浓度Dox诱导的细胞中表达荧光蛋白的细胞数量；用生物多功能发光仪 (激发波长为465 nm±30 nm, 发射波长为525 nm±30 nm) 检测不同浓度Dox诱导的细胞的荧光强度；分别提取不同浓度Dox诱导的细胞中的蛋白，经BCA法定量后，进行SDS-PAGE电泳分离并转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，用抗兔源抗PAC1一抗 (购自Satacus公司)、二抗孵育。用TBS清洗后显色，检测PAC1-EYFP蛋白的表达情况。

1.2.5 转染细胞稳定性的鉴定

将筛选出的表达PAC1-EYFP蛋白的细胞株分别在含有或不含有潮霉素的培养基中连续传10代，期间监测目的蛋白的Dox诱导表达，以判断转染细胞的稳定性。

1.2.6 MTT法检测细胞的生长曲线

用MTT法检测Tet-on表达控制系统中PAC1-EYFP的不同表达水平对细胞增殖活性的影响，在96孔板中培养PAC1-Tet-CHO细胞至60%–70%成片时，加入梯度浓度 (0–1 000 μg/mL)的Dox，每个浓度设置5个复孔，培养48 h，弃掉培养基，PBS清洗2遍，饥饿2–6 h，加入MTT的终浓度为0.5 mg/mL，37 ℃孵育4 h，终止反应，每孔加150 μL异丙醇，37 ℃避光孵育10 min，于酶标仪570 nm处检测，630 nm为参考波长，测定各孔光吸收值，设置无细胞孔为对照，连续测5 d。

2 结果

2.1 pTRE-PAC1-EYFP表达载体的构建

PAC1基因大小为 1 407 bp，融合基因PAC1-EYFP大小为 2 157 bp，将质粒 pEYFPPAC1-EYFP用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后电泳回收2 157 bp的目的片段，连接到pTRE-Tight载体上，得到重组表达载体 pTRE-PAC1-EYFP。采用方法1.2.1中针对PAC1基因编码框1–300 bp的引物，用PCR的方法对重组质粒pTRE-PAC1-EYFP进行初步鉴定，发现重组载体pTRE-PAC1- EYFP可扩增出与预计相符的 300 bp产物 (图1)，然后利用位于 pTRE-Tight质粒多克隆位点上游的引物进行基因测序，经测序确定重组质粒pTRE-PAC1-EYFP中PAC1-EYFP的基因序列与预期结果一致 (图略)，说明成功构建了pTRE- PAC1-EYFP的真核表达载体。

图1 PCR鉴定载体pTRE-PAC1-EYFP的构建Fig. 1 Identification of vector pTRE-PAC1-EYFP by PCR. M1: DNA marker DL2000; 1: pTRE-PAC1-EYFP;2: pTRE-Tight.

2.2 梯度浓度 Dox诱导 PAC1-EYFP的表达和检测

将pTet-on-advance质粒转染至CHO细胞，经800 μg/mLG418筛选获得Neor阳性细胞克隆Tet-CHO，而后将重组质粒 pTRE-PAC1-EYFP和线性潮霉素基因共转染至Tet-CHO细胞，经500 μg/mL潮霉素筛选，挑取新的阳性细胞克隆PAC1-Tet-CHO 扩大培养。用梯度浓度(0–1 000 μg/mL) Dox 诱导 PAC1-EYFP 表达，48 h后在倒置荧光显微镜下观察黄色荧光蛋白的表达(图 2A)，发现Dox诱导PAC1-EYFP的表达有显著的浓度依赖性；没有Dox 诱导的细胞中检测不到黄色荧光蛋白，而随着 Dox浓度的递增则检测到黄色荧光蛋白的量相应增高。生物多功能发光仪检测和Western印迹检测结果也显示，随着 Dox浓度的增加，PAC1-EYFP的荧光强度(图2B) 和蛋白表达水平 (图2C) 均相应增加。结果表明，利用 Tet-on控制表达系统实现了PAC1-EYFP的Dox依赖的可控表达。

图2 荧光显微观察、荧光定量检测和Western印迹检测梯度浓度Dox诱导表达PAC1-EYFPFig. 2 Induced expression of PAC1-EYFP by different concentrations of Dox in PAC1-Tet-CHO cells detected by fluorescence metry assay and Western blotting. (A) The fluorescence microscope showed that the fluorescence signals representing the expression of EYFP-tagged PAC1 increased following the increase of the concentration of Dox(0−1 000 μg/mL). (B) The fluorescence metry assay showed that the fluorescence density of the PAC1-Tet-CHO cells representing the expression of EYFP-tagged PAC1 increased following the increase of the concentration of Dox(0−1 000 μg/mL). (*P<0.01, 100 μg/mL Dox or 1 000 μg/mL Dox compared with 0 μg/mL Dox; # P<0.01, 1 000 μg/mL Dox compared with 100 μg/mL Dox). (C) Western blotting assayed showed the expression of PAC1-EYFP using β-Actin as a control. PAC1-Tet-CHO cells treated with various concentrations Dox 0 μg/mL, 100 μg/mL, 1 000 μg/mL respectively.

2.3 可调控表达细胞系PAC1-Tet-CHO的稳定性评价

将筛选的细胞株PAC1-Tet-CHO在含Hygromycin 的培养基中连续传10代，每代细胞均用Dox诱导并在荧光显微镜下观察，发现细胞仍能高效地可诱导表达PAC1-EYFP，且表达水平没有明显变化，说明我们构建的细胞系稳定性很好。其中第5代和第10代细胞的表达检测结果见图3A、B。此外，即使将细胞株PAC1-Tet-CHO在未加Hygromycin的培养基中连续传代培养10代，发现细胞仍能高效保持Dox依赖的可诱导表达PAC1-EYFP，结果见图3C，说明该细胞株具有传代稳定性。

2.4 MTT检测不同浓度Dox诱导的细胞生长曲线

用MTT法于酶标仪570 nm处检测，630 nm为参考波长，测定各孔光吸收值，设置无细胞孔为对照，连续测5 d，并绘制生长曲线图发现，PAC1-EYFP的表达水平与细胞的增殖活性密切正相关 (图4)；其中，Dox 诱导组 (100 μg/mL、1 000 μg/mL) 的增殖活性显著高于非Dox诱导组(0 μg/mL)，高浓度Dox (1 000 μg/mL) 诱导的细胞增殖活性明显高于低浓度Dox (100 μg/mL) 诱导组。

图4 MTT检测不同浓度Dox诱导的细胞生长曲线图Fig. 4 Grow curves of PAC1-Tet-CHO cells incubated with different concentrations of Dox. The cells viabilities assayed by MTT showed that 1 000 μg/mL Dox and 100 μg/mL Dox led to the higher cells viabilities(*P<0.01, 1 000 μg/mL Dox and 100 μg/mL Dox compared with 0 μg/mL Dox), while 1 000 μg/mL Dox produced significantly higher cells viabilities than 100 μg/mL Dox (#P<0.01, 1 000 μg/mL Dox compared with 100 μg/mL Dox).

3 讨论

在真核细胞的调控表达系统中，Tet-on控制表达系统具有严密性、特异性、高效性等优点[21-22]，诱导剂即为常用的抗生素四环素及其衍生物，在低于其毒性剂量时就能发挥诱导作用，加之则可人为控制目的基因的表达水平，有利于模拟该基因在生理、病理

等不同状态下的作用特点和机制。本研究利用 Tet-on控制表达系统成功建立可控表达 PAC1-EYFP的细胞系PAC1-Tet-CHO，不仅表达水平有显著的Dox浓度依赖性，而且体系非常稳定，从图3中可以看到细胞连续培养10代仍能高效地可诱导表达PAC1-EYFP。这样可调控且稳定表达PAC1-EYFP的细胞系完全可以满足今后对PAC1生物学功能研究的需要。

PAC1参与了介导PACAP促神经细胞增殖和抗凋亡的功能[2-8]，本研究发现PAC1赋予细胞其表达水平依赖的增殖活性——用MTT法检测细胞的生长曲线，图 4中显示同样培养条件下，加Dox浓度高时，细胞的增殖活性较高，未加Dox的对照组增殖活性显然低于加Dox实验组，表明PAC1表达水平越高，其赋予细胞的增殖活性越强。结合PAC1在受损细胞及肿瘤中高表达的发现[9-11]，这些结果提示，细胞可能通过调节的受体 PAC1的表达水平实现对配体的反应程度，从而调节细胞的增殖和抗凋亡的活性。本研究首次揭示了PAC1表达水平与细胞增殖活性的正相关性。

总之，本研究首次利用了 Tet-on控制表达系统成功实现了 Dox依赖的 PAC1-EYFP在CHO细胞的可控表达，构建了遗传稳定的PAC1-Tet-CHO细胞系，并且首次获得了PAC1表达水平与细胞增殖活性正相关的数据，这些研究不仅有助于诠释高表达 PAC1的生理学与病理学的作用和意义，而且为以PAC1为靶点的药物开发提供了新的理论依据和研究基础。例如，或许可以用提高PAC1自身表达水平的方法替代原有的配体激活的方法来开启 PAC1所介导的信号通路，实现以PAC1为靶点的相关神经系统疾病的治疗，借此避免PACAP等多肽配体激活非特异受体而造成的副作用；还或许对于和肿瘤或某些病理过程密切相关的 PAC1的高表达，可以通过抑制其高表达实现对某些肿瘤 (神经内分泌肿瘤) 或某些病理过程 (如创伤后应激障碍，压力性应激障碍等) 的干预和治疗等。

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