VPA 对OA 处理的SH-SY5Y 细胞tau 蛋白磷酸化水平的影响

胡江平，蔡克瑞，金花淑，金在顺，李凯军

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，以进行性痴呆为主要特征，主要的临床表现为:进行性记忆力减退、认知功能下降及严重的精神障碍。其主要的病理特征是:老年斑(senile plaques，SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)、海马锥体细胞颗粒空泡变性和胆碱能神经元缺失。SP 和NFTs 是AD 的两个标志性病理改变，这两种损害都是病理性蛋白沉积的结果:细胞外β 淀粉样蛋白(Aβ)沉积导致SP 形成;细胞内自我聚集的高度磷酸化的tau 蛋白则是形成NFTs 的结构基础［1］。

Tau 蛋白是一种微管相关蛋白，其与成熟神经元结合，对微管形成和稳定微管起重要作用［2，3］。Tau 蛋白磷酸化对tau 与微管的结合至关重要。但是，异常磷酸化的tau 蛋白聚合成配对的双螺旋细丝(paried helical filaments，PHFs)，不利于与微管结合并导致微管网络的不稳定和神经元的死亡［4］。异常磷酸化使tau 蛋白生物学活性丧失，并且与微管蛋白竞争结合正常tau 蛋白或从已经形成的微管上夺取tau 蛋白，导致正常情况下其稳定微管和促进微管蛋白聚合成微管的作用消失，Tau 蛋白的过度磷酸化被认为是关键因素。AD 患者脑中tau 蛋白总量多于正常人，正常tau 蛋白减少而异常过度磷酸化tau 蛋白大量增加，而且数量与患者的痴呆程度成正相关，在痴呆发展过程中起重要作用［5，6］。因此，过度磷酸化的tau 蛋白与AD 的形成和发展有着密切的联系。

冈田酸(Okadaic acid，OA)是一种海洋生物提取物，可选择性抑制蛋白磷酸酯酶，对PP2A 作用最强，使蛋白高度磷酸化，并可以引起氧化损伤，在离体培养的海马神经元中能够诱导tau 蛋白过度磷酸化;OA 对于磷酸酶的调节作用不仅是通过抑制磷酸酶的活性，同时还可以间接激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)等其它酶完成。正常情况下磷酸化tau 蛋白分布在神经元突起，而非磷酸化的tau 蛋白分布在胞体，经过OA 处理的磷酸化与非磷酸化tau蛋白均趋于胞体内，提示过度磷酸化驱使tau 蛋白在胞体内聚集。OA 在体内能促进Aβ 沉积，造成神经元退化，突触缺失及记忆障碍，产生类似AD 样病理特征。Tau 蛋白的过度磷酸化又促进了APP 蛋白的表达，推测在tau 蛋白的过度磷酸化与Aβ 生成之间可能存在一种调节机制，使AD 出现Aβ 沉积和tau 蛋白的过度磷酸化、NFTs 之间存在相互促进机制，造成AD 患者临床症状加重。因此选用OA 孵育SH-SY5Y 细胞制备tau 蛋白过度磷酸化的细胞模型。

为了在体外验证VPA 对tau 蛋白磷酸化的影响，我们选用SH-SY5Y 细胞作为研究对象，观察VPA 对OA 处理的SH-SY5Y 细胞tau 蛋白磷酸化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，DMEM 培养基购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Invitrogen 公司，胰蛋白酶购自美国Invitrogen 公司，冈田酸购自美国santa cruz 公司，小鼠抗p-tau (Thr231)购自美国Invitrogen 公司，小鼠抗GAPDH 抗体购自Kangchen 公司，蛋白marker 购自NEB 公司，PVDF 膜购自美国Millipore 公司，ECL 试剂盒购自美国Pierce 公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma 公司，DMSO 购自美国Sigma 公司，青霉素、链霉素及其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 实验分组 常规细胞培养后分为3 组。(1)V 组:正常培养细胞，未加其它干预的SH-SY5Y细胞，加等体积的无血清培养基;(2)C 组:40 nmol/L OA 孵育SH-SY5Y 细胞12 h 后，加入等体积的无血清培养基;(3)T 组:40 nmol/L OA 孵育12 h 后加入10 mmol/L VPA 孵育12 h。

1.3 细胞培养 SH-SY5Y 细胞复苏后，加入适量含10%胎牛血清的DMEM 培养液，将其吹打成细胞悬液，均匀接种于培养瓶中，于37 ℃、5%CO2、100%湿度CO2培养箱中静置培养。

1.4 MTT 测定 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养液配成单细胞悬液，每孔100 μl 接种于96 孔培养板，移入培养箱，待细胞完全贴壁后，每孔加入终浓度分别为20、40、80、160 nmol/L 的含有OA 的培养液，对照组加等体积的培养液。每种浓度6 个复孔，培养12 h 后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，继续孵育3 h，弃上清，每孔加150 μl DMSO，在水平摇床上震荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪测定光密度值(490 nm);VPA 的MTT 测定方法同上，浓度分别为1、10、20、50、70、100 mmol/L。

1.5 Western blot 检测 收集细胞后进行蛋白提取及浓度的测定，经灌胶、每管50 μg 加样、电泳(浓缩胶内电泳时的电压为90 V，其进入分离胶后将电压调整为110 V)、50 V 室温转膜2 h、5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h、一抗及二抗孵育后，应用HRP-ECL 发光法检测蛋白，用BIO-RAD 凝胶电泳图像分析仪进行图像采集，Image J 软件进行图像分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS 16.0 软件，结果以均值±标准差()表示，经方差齐性检验后，对数据进行t 检验，P ＜0.01 被认为有显著性差异。

2 结果

2.1 OA 对SH-SY5Y 细胞活力的影响 SHSY5Y 细胞经不同浓度OA 处理12 h 后，测定OD值，以正常对照组细胞活力为100%，其余各组OD值与之相比得到各自的细胞活力，结果显示:当OA浓度大于40 nmol/L 时，细胞活力受到明显的抑制，且随着OA 浓度的增加而增强，而低于此浓度的OA对细胞活力没有明显的影响(见图1)。我们选择细胞活力在80%以上的药物浓度处理细胞。

2.2 VPA 对SH-SY5Y 细胞活力的影响 SHSY5Y 细胞经不同浓度VPA 作用12 h 后，测定OD值，以正常对照组细胞活力为100%，其余各组OD值与之相比得到各自的细胞活力。当VPA 浓度小于20 mmol/L 时，细胞活力维持在80%以上(见图2)。我们选择10nmol/LVPA 作为实验浓度。

2.3 VPA 对OA 处理的SH-SY5Y 细胞tau 蛋白磷酸化的影响 SH-SY5Y 细胞经OA 处理(40 mmol/L，12 h)后，加入VPA(10 mmol/L，12 h)提取细胞蛋白，检测p-tau 和总tau 在Thr231 位点的表达水平。Western blot 结果显示，T 组的tau 蛋白磷酸化水平与C 组相比降低了37.1%，与V 组水平相近。光密度值以GAPDH 作为内参校正。数据以平均数±标准差()表示，与对照组相比＊＊P ＜0.01(见图3)。

图1 OA 对SH-SY5Y 细胞活力的影响

图2 VPA 对SH-SY5Y 细胞活力的影响

图3 VPA 对OA 处理的SH-SY5Y 细胞tau 蛋白磷酸化的影响

3 讨论

AD 的重要病理变化之一是神经细胞内的NFTs形成，其主要成分就是过度磷酸化的tau 蛋白［7］，Tau 是一种微管相关蛋白，与成熟神经元结合，对促进微管形成、稳定微管系统起着重要作用。Tau 蛋白磷酸化对tau 与微管的结合至关重要，异常磷酸化的tau 蛋白聚合成PHFs，不利于与微管结合并导致微管网络的不稳定和神经元死亡。NFTs 的形成与tau 蛋白过度磷酸化密切相关，在AD 患者脑中，过度磷酸化的tau 蛋白明显增加，且NFTs 的数量与痴呆患者的程度呈正相关［8］。在AD 脑组织中，异常过度磷酸化的tau 蛋白含量显著增高，并聚集成双螺旋细丝，Tau 磷酸化程度的增加使tau 结合微管的能力下降，从而丧失了促进微管组装的生物活性，导致细胞骨架的结构异常和神经细胞死亡。AD 患者有21个异常磷酸化位点，其中研究较多的有Ser199、Thr205、Thr212、Thr231、Ser396 和Ser404 等多个磷酸化位点［9］，本实验选取常用的Thr231 位点进行检测。

OA 能够阻止tau 蛋白的去磷酸化，导致tau 蛋白的异常过度磷酸化，产生AD 样的病理过程［10］，适合用来制备AD 时tau 蛋白过度磷酸化的细胞模型。MTT 实验表明，OA 浓度大于40 nmol/L 时，细胞活力受到明显的抑制，因此我们选择40 nmol/L OA 处理12 h 作为制备AD 时tau 蛋白过度磷酸化的细胞模型。在制备tau 蛋白磷酸化的细胞模型后，进一步观察VPA 对tau 蛋白磷酸化的影响。采用40 nmol/L OA 作用于SH-SY5Y 细胞，建立tau 蛋白磷酸化的细胞模型，然后给予VPA 处理，观察其对tau 蛋白磷酸化水平的影响，当VPA 浓度小于20 mmol/L 时，细胞活力维持在80%以上，我们选择10 mmol/L VPA 作为实验浓度，Western blot 检测显示，VPA 可以降低OA 处理的细胞模型在Thr231 位点的tau 蛋白磷酸化水平。

本实验结果表明，对于OA 诱导的SH-SY5Y 细胞给予VPA 处理，Tau 蛋白磷酸化水平明显降低，与正常细胞tau 蛋白磷酸化水平相当，表明VPA 对tau 蛋白磷酸化具有明显的抑制作用，说明VPA 对AD 的治疗具有积极的作用，其机制很可能是通过减少tau 蛋白磷酸化水平而发挥作用的。

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