液相色谱-质谱法和高效液相色谱法定性定量测定籽瓜中的L-瓜氨酸

席冬华，李维霞，高 晶，阿塔吾拉·铁木尔，李 玲，吴 斌,*

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046；3.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆 乌鲁木齐 830091）

液相色谱-质谱法和高效液相色谱法定性定量测定籽瓜中的L-瓜氨酸

席冬华1，李维霞1，高 晶2，阿塔吾拉·铁木尔3，李 玲1，吴 斌3,*

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046；3.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆 乌鲁木齐 830091）

建立一种非衍生化样品前处理的液相色谱-质谱和高效液相色谱方法，对籽瓜中的L-瓜氨酸进行定性、定量分析，通过单因素试验和正交试验优化提取条件。液相色谱-质谱条件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相：10%乙腈和90%甲醇溶液（甲醇-水体积比1∶1）；流速0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量10 μL。在电喷雾离子源正模式、多反应监测扫描方式下分析，L-瓜氨酸的定性离子对为m/z 176.09/158.9，m/z 176.09/112.9，定量离子对为m/z 176.09/158.9。高效液相色谱条件：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以0.03 mmol/L磷酸为流动相，流速0.7 mL/min，柱温30 ℃，检测波长202 nm。结果表明：L-瓜氨酸标准品在0.5～100 μg/mL范围内线性关系良好（R2=0.999 9），平均回收率在95.12%～104.21%之间，相对标准偏差为1.86%～4.75%（n=3）。籽瓜中含有丰富的L-瓜氨酸，本方法测得籽瓜样品中L-瓜氨酸的平均含量为0.656～2.563 mg/g。

籽瓜；L-瓜氨酸；非衍生化；液相色谱-质谱法；高效液相色谱法

瓜氨酸名称来源于西瓜的拉丁名Citrullus vulgaris，是首先从西瓜汁中发现的人体内非蛋白质α-氨基酸，它具有肽键形成的能力，但是不参与蛋白质的合成，与大多数氨基酸构像一样为L型，故又称为L-瓜氨酸[1]。L-瓜氨酸具有防治前列腺疾病，提高男性性功能、抗衰老、增强免疫力、保持胆固醇正常、诊断类风湿性关节炎、维护关节运动技能、平衡正常的血糖水平、提高脑力清晰度、护肤祛斑等功效[2]。L-瓜氨酸可以通过化学合成[3]、发 酵法、酶法合成[4]和天然产物分离提取[5-6]等方法获得。化学合成L-瓜氨酸的方法存在产品纯度不够和环境危害，应用受到限制；发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，最高仅为1.7 g/L，成本较高[7]；酶法合成L-瓜氨酸产物浓度高，但是转化率较低，同时会产生杂酶, 影响瓜氨酸的生产；而天然产物中分离的L-瓜氨酸纯度较好，具有绿色、无毒副作用等特点倍受青睐。西瓜、天花粉和栝楼根中含有L-瓜氨酸[8-9]，但受到原料来源有限和含量不高制约，生产规模较小。因此找到一种广泛生长的富含L-瓜氨酸的植物也是一种很好的研究方向[2]。

目前，分析L-瓜氨酸的方法主要有阿氏法[10]、薄层色谱法[11]、酶法[12]、分光光度法[6,13]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-16]、气相色谱-质谱法[17]和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[18-19]等。由于L-瓜氨酸具有高的亲水特性和弱的紫外吸收，大多数研究报道的分析方法均需要衍生，衍生过程较复杂，衍生试剂毒性较高。因此建立一种非衍生化分析检测L-瓜氨酸的方法成为近年来研究方向之一。

籽瓜（又称打瓜）是葫芦科西瓜属普通西瓜的栽培变种，一种极具地域特色的农产品，籽瓜主要产于中国，新疆是中国籽瓜最大的产区。目前，对籽瓜的利用只有取籽加工，其余约占瓜质量95%以上的部分都作为废物而被丢弃[20]，造成极大的资源浪费。本实验建立一种非衍生化的前处理LC-MS-MS法对籽瓜中L-瓜氨酸做了定性分析，以及HPLC方法快速简便测定籽瓜中L-瓜氨酸含量，为籽瓜功能性成分研究和籽瓜资源的深加工提供了理论依据，也为植物源L-瓜氨酸的研究与应用提供新的原料来源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同籽瓜品种材料来源见表1；L-瓜氨酸标准品（纯度≥98%） 中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 霍尼韦尔贸易有限公司；磷酸、甲醇（均为分析纯） 天津市福晨化学试剂厂。实验室用水均为高纯水（≥18 MΩ·cm）。

表1 不同品种籽瓜材料Table 1 Different seeding watermelon cultivars

1.2 仪器与设备

1260 HPLC仪（配有可变波长紫外检测器、示差折光检测器和EZChrom Elite工作站） 美国安捷伦公司；Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱北京迪马科技有限公司；Quattro Premier LC-MS-MS联用仪（配有电喷雾离子源和MassLynx4.1软件操作系统） 美国Waters公司；UV-2600紫外-可见分光光度计日本岛津公司；DZG-303A“艾柯”实验室专用超纯水仪成都唐氏康宁科技发展有限公司；Anke GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；IKA®A 11基本型研磨机 广州仪科实验室技术有限公司；LGJ-10冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；SK720H型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将籽瓜清洗去籽，去表皮，分离瓜心、瓜瓤和瓜皮，冷冻，粉碎，保存在－80 ℃冰箱待用。称取1.0 g籽瓜样品，精确至0.01 g，置于50 mL离心管，加入40 mL提取剂（甲醇-1 mol/L盐酸（9∶1，V/V））摇匀后，超声提取30 min，加入8 mL 0.5 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值，用滤纸过滤，12 000 r/min离心20 min，取上清液用0.22 μm有机滤膜过滤，待测。

1.3.2 标准溶液的配制

精确称取0.020 0 g L-瓜氨酸标准品，用50%甲醇溶液溶解定容至100 mL，该储备液质量浓度为200 μg/mL，再依次配制成0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 μg/mL一系列不同质量浓度的标准工作溶液。

1.3.3 液相色谱-质谱分析条件

色谱条件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：10%乙腈和90%甲醇溶液（甲醇-水（1∶1，V/V））；流速0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量10 μL。

质谱条件：毛细管电压3.0 kV；脱溶剂温度350 ℃；锥孔气流量50 L/h；干燥气为氮气，流量为650 L/h，碰撞气体为氩气，流量为0.18 mL/min；电喷雾离子源；正离子模式扫描；多反应监测（multi reaction monitoring mode，MRM）方式检测。其他参数见表2。

表2 检测L-瓜氨酸的质谱条件Table 2 MS conditions for the detection of L-citrulline

1.3.4 HPLC分析条件

色谱柱：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.03 mmol/L磷酸；流速：0.7 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：202 nm；进样量20 μL。

1.3.5 提取条件优化

提取条件单因素水平：提取剂 为a（甲醇-1 mol/L盐酸（9∶1））、b（甲醇-1 mol/L盐酸（18∶1））、c（乙醇-1 mol/L盐酸（9∶1））、d（乙醇-1 mol/L 盐酸（18∶1））、e（pH值为3的盐酸溶液）、f（高纯水）；料液比（g/mL）为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；提取时间为5、10、20、30、45、60 min（超声时用温度计实时监测温度，控制温度变化小于5 ℃）。

2 结果与分析

2.1 籽瓜中L-瓜氨酸的鉴定

图 11 L-瓜氨酸标准品和籽瓜样品MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of L-citrulline in standard solution and seeding watermelon sample

对1 μg/mL L-瓜氨酸标准物质进行一级全扫描和子离子扫描，确定L-瓜氨酸的母离子和子离子，选择两个丰度较高、干扰较少的子离子作为定性离子和定量离子，其MRM色谱图如图1a所示。将籽瓜瓤样品按样品处理方法处理稀释后，进样10 μL，得到MRM色谱图如图1b所示。可以看出籽瓜样品中目标物质的峰与L-瓜氨酸标准品的峰保留时间一致，选择的特征离子的保留时间及丰度之比与标准品的一致，确定目标物质为L-瓜氨酸，该方法能够用于籽瓜样品中L-瓜氨酸的定性分析。在此基础上，本实验建立了一种快速简便的HPLC方法检测籽瓜中L-瓜氨酸的含量。

2.2 提取条件的优化

以L-瓜氨酸的提取量为指标，采用单因素试验和正交试验对提取条件进行了优化。由于甲醇的沸点为64.5 ℃，提取温度过高容易造成提取剂的损失，影响实验结果，钱骅等[9]研究表明25 ℃时瓜氨酸提取率较高，提取一次即可提取完全。因此选择考察提取剂、料液比和提取时间3 个参数。

图2 提取剂对籽瓜中L-瓜氨酸含量的影响Fig.2 Effect of extraction solvents on L-citrulline recovery from seeding watermelon

2.2.1 提取溶剂的优化提取液中加入盐酸是为了调节提取液pH值呈酸性，提取液pH值在L-瓜氨酸等电点（pH 5.97）时，溶解性最低，提取效果不好，呈酸性时水溶性增大，也避免了碱性条件下的糊化现象，提取效果较好[5]。如图2所示，在相同酸性条件下，由于甲醇穿透细胞壁的能力比乙醇强，L-瓜氨酸的提取量：a高于c，b高于d；在无有机提取剂的条件下，盐酸溶液提取量比高纯水高，说明酸性条件下有利于提取L-瓜氨酸，本实验选择a作提取液。甲醇毒性大，宜用于分析测试过程中少量提取，在实际大量生产提取时，可选择价格低廉、无毒的乙醇或者盐酸溶液做提取溶剂。

2.2.2 料液比的优化

图3 料液比对籽瓜中L-瓜氨酸含量的影响Fig.3 Effect of material/liquid ratio on L-citrulline recovery from seeding watermelon

由图3可知，提取液使用量越大，L-瓜氨酸含量越高，在料液比为1∶40时，L-瓜氨酸的含量不再随着提取液用量增大而提高，提取液浓度太低也会增加后续分离工作的负担，故选择料液比为1∶40提取。

2.2.3 提取时间的优化

由图4所示，提取时间低于30min时，L-瓜氨酸的提取量随时间的延长又较明显的提高，随后呈下降趋势，可能由于杂质增多影响L-瓜氨酸的提取分离。

图4 提取时间对籽瓜中L-瓜氨酸含量的影响Fig.4 Effect of extraction duration on L-citrulline recovery from seeding watermelon

2.2.4 正交试验

在单因素试验基础上，对提取剂、料液比和提取时间3 个因素设计L9（33）正交试验设计及结果见表3。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Results of orthogonal experiments and range analysis

由表3可知，影响籽瓜中L-瓜氨酸提取量主次因素为B＞C＞A，即提取剂为最主要因素，料液比和提取时间为次要因素。从各因素极差分析结果得出最佳提取条件为A2B1C2，正交试验中4号试验恰好是此条件的组合，故最优提取条件为甲醇-1 mol/L盐酸溶液（9∶1，V/V）作提取剂、料液比1∶40、提取时间30 min。

2.3 液相分离条件优化

研究表明C18柱能分离西瓜中的L-瓜氨酸[14]，为了选择适合分析籽瓜样品的色谱柱，本实验选用Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Anilent Technologies C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）色谱柱进行分离实验。实验结果表明Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分离效果较好。同时考察不同浓度的磷酸的分离效果，最终确定0.03 mmol/L磷酸作为流动相。通过紫外-可见分光光度计在190～400 nm扫描，优化检测波长为202 nm。

2.4 标准品及籽瓜中L-瓜氨酸的色谱图

将L-瓜氨酸标准品和籽瓜样品提取液分别注入HPLC仪，色谱图见图5。可见L-瓜氨酸信号峰能与其他杂质峰分离，此方法可用来分析籽瓜中的L-瓜氨酸。

图 55 L-瓜氨酸标准品（A）和籽瓜样品（B）HPLC色谱图Fig.5 Chromatograms of L-citrulline standard (A) and seeding watermelon sample (B)

2.5 方法考察

2.5.1 标准曲线和检出限

外标法以标准品溶液的峰面积Y和其质量浓度X/（μg/mL）作图，如图6所示，得回归方程Y=183 581.261 76X+30 791.954 61，R2=0.999 9。将最小质量浓度的标准品溶液无限稀释，按照既定方法进样测定空白和稀释的标准品溶液，计算信噪比，3倍信噪比对应的标准品质量浓度确定的检出限为0.02 μg/mL，10倍信噪比对应的标准品质量浓度确定的定量限为0.08 μg/mL。

图6 6 L-瓜氨酸标准曲线Fig.6 Standard calibration curve of L-citrulline

2.5.2 方法精密度

表4 精密度实验结果（n=5）Table 4 Results of precise tests (n = 5)

在HPLC色谱条件下，分别对10 μg/mL和50 μg/mL的L-瓜氨酸标准品溶液，进样量20 μL，重复进样5 次，计算相对标准偏差分别为0.74%和0.31%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性实验

精密称取同一籽瓜样品5 份，制备成供试样品溶液，用HPLC分别测定，计算相对标准偏差为3.16%，表明该方法重复性较好。

表5 重复性实验结果（n=5）Table 5 Results of repeatability tests（n=5）

2.5.4 加标回收实验

在黑丰1号籽瓜的瓜心、瓜瓤和瓜皮样品中分别加入一定量外源标准L-瓜氨酸，然后按照样品溶液测定步骤进行定量分析。根据标准曲线，利用峰面积计算平均回收率和相对标准偏差，见表6。该方法回收率在95.12%～104.21%之间，相对标准偏差在1.86%～4.75%之间，表明该方法能准确测定籽瓜中L-瓜氨酸的含量。

表6 加标回收实验结果（n=3）Table 6 Results of recovery tests (n =3)

2.6 实际样品分析

采用本实验建立的HPLC方法对实际样品进行测试。由表7可见，新疆主要种植的籽瓜品种果实中L-瓜氨酸平均含量在0.656～2.563 mg/g。不同品种间瓜氨酸含量差异明显，其中SW6平均含量最高，达到2.563 mg/g，其次是SW1，含量为2.374 mg/g，含量最低的是SW3，只有0.656 mg/g。同品种的籽瓜种植在不同产区L-瓜氨酸含量存在差异，见SW1和SW2，SW4和SW5，存在差异的原因可能与气候、土壤、人工管理等因素有关，有待进一步研究。对于同一个籽瓜而言，不同部位的L-瓜氨酸含量有所不同，SW1和SW2中L-瓜氨酸含量：瓜皮＞瓜瓤＞瓜心；SW3、SW5、SW6和SW7中L-瓜氨酸含量：瓜心＞瓜瓤＞瓜皮；而SW4则是瓜瓤＞瓜心＞瓜皮。

表7 不同籽瓜品种果实不同部位L-瓜氨酸含量（n=3）Tabllee 77 L-Citrulline contents in different parts of seedling watermelon from different varieties (n = 3) mg/g

3 结 论

本研究表明，籽瓜中含有丰富的L-瓜氨酸，LC-MSMS法可对籽瓜中的L-瓜氨酸进行准确定性，HPLC法可以快速、灵敏检测籽瓜中L-瓜氨酸的含量。本方法前处理步骤简单、无需衍生、重复性好、回收率符合要求。通过对实际样品的检测，可知新疆主要种植的籽瓜品种果实中L-瓜氨酸平均含量在0.656～2.563mg/g，不同品种籽瓜中L-瓜氨酸含量存在差异，同一个籽瓜不同部位L-瓜氨酸含量有所不同，相同品种的籽瓜种植的地区不同也会影响L-瓜氨酸含量，存在含量差异的因素需要进一步研究。本实验为籽瓜副产物的充分利用提供参考依据。

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Identification and Quantitation of L-Citrulline in Seeding Watermelon by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and Rapid High Performance Liquid Chromatography

XI Dong-hua1, LI Wei-xia1, GAO Jing2, ATAWULLA•Tiemur3, LI Ling1, WU Bin3,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Ürümqi 830046, China; 2. Center for Physics and Chemistry Analysis, Xinjiang University, Ürümqi 830046, China; 3. Institute of Agro-Products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Ürümqi 830091, China)

In this work, certification of L-citrulline in seeding watermelon extract by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS), and rapid determination of underivatized L-citrulline in seeding watermelon by high performance liquid chromatography (HPLC) were established. Single factor and orthogonal experiments were used to optimize the extraction conditions. LC-MS-MS analysis was carried out using Acuity C18(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) as the stationary phase and a mixture of 10% acetonitrile and 90% methanol-water (50:50, V/V) as the mobile phase at a fl ow rate of 0.2 mL/min with a column temperature of 40 ℃. The electrospray ionization (ESI) source was applied and operated in a positive ion mode. The diagnostic product ions of L-citrulline were m/z 176.09/158.9 and m/z 176.09/112.9. Moreover, the ion pair of m/z 176.09/158.9 was used for quantification. HPLC separation was performed suing Platisil ODS C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) as the stationary phase and 0.03 mmol/L phosphoric acid as the mobile phase at a fl ow rate of 0.7 mL/min with a column temperature of 30 ℃, and the detection wavelength was set at 202 nm. The results showed that a good linear relationship was obtained for L-citrulline in the concentration range of 0.5–100 μg/mL with R2= 0.999 9. Average recoveries varied from 95.12% to 104.21% with RSD of 1.86%–4.75% (n = 3). The content of L-citrulline in seeding watermelon was determined to be 0.656–2.563 mg/g.

seeding watermelon; L-citrulline; non-derivatization; liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630（2014）24-0271-06

10.7506/spkx1002-6630-201424052

2014-03-21

新疆维吾尔自治区级公益性科研院所基本科研业务费专项（KY2013045；KY2014038）

席冬华（1990—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物的分析。E-mail：553764469@qq.com

*通信作者：吴斌（1973—），男，副研究员，博士，研究方向为农产品贮藏与加工。E-mail：xjuwubin0320@sina.com