Caco-2细胞模型构建及抗高血压肽VPP和IPP小肠吸收机制研究

祝 倩，郭宇星,*，潘道东,，曾小群，孙杨赢，周慧敏

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211）

Caco-2细胞模型构建及抗高血压肽VPP和IPP小肠吸收机制研究

祝 倩1，郭宇星1,*，潘道东1,2，曾小群2，孙杨赢2，周慧敏1

（1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211）

Caco-2细胞模型为小肠内皮细胞转运模型，本实验构建Caco-2细胞模型并研究抗高血压肽Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP）的小肠吸收机制。从细胞形态、电阻值和荧光素钠透过率等方面验证了Caco-2细胞模型；通过转运时间、肽浓度、吸收抑制剂和促进剂比较了VPP和IPP的小肠转运途径及外排机制。结果表明：构建的Caco-2细胞模型可用于VPP和IPP的模拟小肠吸收机制研究；VPP和IPP的小肠转运途径是旁路转运，VPP和IPP都存在外排泵的作用，IPP外排作用没有VPP大，所以生物利用度高于VPP。

抗高血压肽；Val-Pro-Pro；Ile-Pro-Pro；Caco-2细胞；转运

Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP）是从瑞士乳杆菌发酵乳中分离出的具有抗高血压活性的肽，它们除了表现出有效的体外血管紧张素转化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE）抑制活性，在用自发性高血压大鼠的体内实验中也表现出了降低血压的作用[1]。Nakamura等[2]在1995年用Lactobacillus helveticus和Saccharomyces cerevisiae作为发酵剂制作了一种名为Calpis的酸乳饮料，经自发性高血压大鼠（spontaneonsly hypertensive rats，SHP）长期服用后，可抑制血压上升，随后从Calpis中提取出具有ACE抑制活性的2 种活性短肽——VPP和IPP，实验表明，Calpis的ACE抑制活性主要是这2 种肽的作用。

Caco-2细胞最初于1977年从人类结肠腺癌细胞中分离所得[3]。将细胞接种到聚碳酸酯膜或聚酯膜上，经过约21 d的培养，形成连续的单层并且具备与人类小肠上皮细胞相似的微绒毛结构，部分表达出与小肠上皮相同的某些特征酶，如氨基肽酶、酯酶、乳糖酶、蔗糖酶等[4]。Caco-2细胞模型与其他用来研究吸收的模型相比，重复性较好，模型稳定并且应用范围广，成为一种研究药物吸收的快速筛选工具，可以提供药物分子穿过小肠黏膜的吸收、代谢、转运的情况[5]。构建Caco-2细胞模型时，需对形态学、荧光素钠透过量、跨膜电阻等参数进行测定和评估，确保Caco-2细胞模型可作为小肠内皮细胞的转运模型[6]。

Ohsawa等[7]通过实验得出VPP和IPP能抵制住胃肠道分泌出的蛋白酶，不会被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰液素水解，并发现这两个三肽在Caco-2细胞模型中不会被酶解，表明口服VPP和IPP能在肠道中保持结构完整，并能保持活力直到吸收。Pijl等[8]研究VPP和IPP在猪体内的药代动力学时发现，这两种三肽都能以完整的形式进入血液循环，而且有绝对的生物利用度。由此可知，VPP和IPP是以完整结构通过小肠吸收，但其吸收机制尚未完全确定。因此，本实验建立并验证了Caco-2细胞模型，并通过此模型研究抗高血压肽VPP和IPP的跨小肠上皮细胞的转运机制，此模型的确定为研究同类短肽提供实验基础，对短肽的小肠吸收机制提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Caco-2细胞 南京凯基生物科技有限公司；VPP、IPP、Gly-Pro（纯度＞95%） 上海楚肽生物科技有限公司合成。

不完全DMEM培养基（原装Gibco干粉配制，含1%双抗）、胎牛血清（特优级Gibco），以及实验所需的缓冲液 南京凯基生物科技发展有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索莱宝科技有限公司；非必需氨基酸、青链霉素混合液、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 美国Amresco公司；荧光素钠、维拉帕米、MK-571钠盐、去氧胆酸钠、渥曼青霉素（wortmannin） 美国Sigma公司；叠氮化钠 浙江省东阳市天宇化工有限公司。

1.2 仪器与设备

12孔Transwell培养板（聚酯膜，孔径0.4 μm，膜面积1.12 cm2） 美国康宁公司；Millicell ERS-2电阻仪 美国Millipore公司；XD-202型倒置生物显微镜 南京江南永新光学有限公司；MCO-15AC型CO2培养箱 日本三洋公司；25 cm2密封盖培养瓶 丹麦NUNC公司；754紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Agilent高效液相色谱仪（配置C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）） 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 Caco-2细胞模型的建立[9]

将含10%胎牛血清的DMEM培养液作为Caco-2细胞的培养液，接种于25 cm2培养瓶中于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，隔天更换培养液一次。细胞在瓶中长至80%～90%时，吸弃旧的培养液，加入0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液进行消化，用DMEM培养液制成细胞悬液，以密度2×105cells/mL接种于12 孔Transwell板的滤膜上。在滤膜的顶侧（apical side，AP）和基底侧（basolateral side，BL）分别加入细胞悬液0.5 mL和DMEM培养液1.5 mL。24 h后换培养液，前7 d隔天换液，以后每天换液，培养21 d。

1.3.2 Caco-2细胞模型的评价指标

1.3.2.1 细胞形态学观察[10]

培养至21 d时，将细胞单层用HBSS（Hanks’balanced salt solutions）溶液清洗3 次，切下聚脂膜，固定于体积分数3%戊二醛，再用体积分数1%四氧化锇固定，丙酮逐级脱水，以不氧树脂Epon812为包埋剂，半薄切片定位后进行超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，在透射电镜下观察其特征的微绒毛结构。微绒毛的特征表现和细胞特点的紧密性可以反映出细胞层的分化程度。

1.3.2.2 细胞单层完整（紧密）性测定

用细胞电阻仪隔天测定跨上皮细胞电阻（transepithelial electrical resistance，TEER），以了解细胞单层完整性与紧密性动态形成过程。

一般TEER值介于200～1 000 Ω·cm2，电阻值越大，表示单层越致密。

1.3.2.3 荧光素钠渗漏检查

采用荧光素钠来验证被动扩散的跨膜通量[11]。荧光素钠水溶性极强，且从细胞间隙进行转运，通常被用来检测细胞单层的完整性。以未接种细胞的Transwell培养皿用HBSS缓冲液分别配制0.5、1、2、4、10 μg/mL荧光素钠标准溶液，在492 nm波长处检测，以吸光度为纵坐标，荧光素钠质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到方程：y=108.87x+0.018 0（R2=0.998 1），线性范围0.5～10 μg/mL。细胞在Transwell板上生长达21 d后，弃去培养液，用预热至37 ℃的HBSS清洗3 次。第3次放入CO2培养箱中孵育30 min，小心吸弃HBSS，每孔AP侧加入0.5 mL 0.4 g/L荧光素钠，BL侧加入1.5 mL HBSS，CO2培养箱中培养，在30、60、90、120、150 min分别取底侧HBSS，在紫外-可见分光光度计492 nm波长处测定吸光度，以未接种细胞的培养皿作为空白组，按公式（2）计算透过率。

1.3.3 VPP和IPP跨细胞膜转运

1.3.3.1 肽跨细胞转运实验

细胞用HBSS（pH 7.4）缓冲液小心冲洗3 次，第3次在37 ℃培养箱中孵育30 min后轻轻吸去孔内HBSS。在AP侧加入含有肽的HBSS缓冲液0.5 mL，在BL侧加入HBSS 1.5 mL。每次取样500 μL并补上同样量的HBSS缓冲液，样品中的VPP和IPP的含量用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定。BL侧取出的转运样品经0.22 μm膜过滤进样。色谱条件：流动相：22%乙腈，0.05% 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）；流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，在波长202 nm处检测峰值。

1.3.3.2 转运时间对VPP跨膜转运的影响

在Transwell板的AP侧加1 mmol/L的VPP，在37 ℃孵育0.5、1、1.5、2 h后从BL侧取样，通过HPLC测定VPP浓度。

1.3.3.3 肽浓度对VPP跨膜转运的影响

在AP侧分别加1、2、3、4、5 mmol/L的VPP，于37 ℃培养箱孵育1 h后从BL侧取样，通过测定VPP浓度确定VPP跨细胞膜转运量。

1.3.3.4 VPP及IPP的跨膜转运机制

在Transwell板的AP侧分别加入肽转运载体竞争性抑制剂10 mmol/L Gly-Pro、内吞抑制剂500 nmol/L的Wortmannin和旁路转运促进剂100 μmol/L去氧胆酸钠[12-13]，对BL侧样品做液相分析肽浓度。

1.3.3.5 VPP及IPP的外排机制

在AP侧分别加入100 μmol/L的P-糖蛋白抑制剂维拉帕米、50 μmol/L多药耐药蛋白抑制剂MK-571和10 mmol/L的ATP能量生成抑制剂叠氮化钠[13]，转运1 h后，对BL侧样品做液相分析肽浓度。

1.4 数据处理

用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，单因素方差分析检验组间显著性差异，数据用示，组间差异显著性采用t检验。

2 结果与分析

2.1 Caco-2细胞模型的建立及验证

2.1.1 细胞形态学检查

由图1可知，细胞单层上侧分化出了微绒毛结构，刷状缘非常整齐致密。细胞间有紧密连接结构，且紧密连接只出现在腔侧。微绒毛是Caco-2细胞分化后的典型特征，微绒毛（图1a）、紧密连接（图1b）的出现说明Caco-2细胞已成不对称分布，具有小肠上皮细胞的某些结构特征。

图1 透射电镜下观察Caco-2细胞单层Fig.1 Transmission electron microscope picture of Caco-2 cells

2.1.2 细胞单层完整性

图2 Caco-2细胞的TEER值与生长时间的关系Fig.2 Relationship between transepithelial electrical resistance of Caco-2 monolayers and culture time

由图2可知，Caco-2细胞单层的紧密性随培养时间延长而逐渐增高。第21天时已达500 Ω·cm2多。细胞的跨膜电阻在第1周增加缓慢，到第7天电阻还没达到100 Ω·cm2，而后快速增加，到第14天时已经介于300～400 Ω·cm2之间，最后1 周缓慢增加，到21 d时跨膜电阻增至519 Ω·cm2。本实验建立的Caco-2细胞模型TEER值为400～700 Ω·cm2，符合实验要求。

2.1.3 荧光素钠渗漏检查

图3 荧光素钠透过Transwell的透过率和时间的关系Fig.3 Relationship between fluorescein permeability and time

由图3可知，空白组的荧光素钠透过率较实验组高。接入荧光素钠0.5～2.5 h时，空白组透过率由7.6%增至29.6%，实验组透过率从0.6%增至6.4%。荧光素钠是Caco-2细胞单层模型跨细胞被动转运的标记物，根据国际上对药物吸收难易的标准，表观通透系数Papp＜1.0×10-6cm/s为吸收不良药物，吸收率在0～20%[14]，本实验荧光素钠在2.5 h内吸收率为6.4%，表明细胞单层紧密，可作为建模的基础。

2.2 VPP和IPP的跨膜转运特性

2.2.1 转运时间对VPP跨膜转运的影响

图4 转运时间对VPP跨Caco-2细胞膜转运的影响Fig.4 Time-course curve of VPP transport across the Caco-2 cell monolayer

由图4可知，VPP在2 h内的转运量随时间延长而增加，在0.5 h内BL侧肽浓度迅速增加，0.5 h后浓度增长速率降低。随着肽从AP侧转运至BL侧，AP侧肽浓度降低，而BL侧肽浓度升高，浓度差的缩小使其转运速率逐步降低，而肽转运的理想透过率为50%，综合考虑实验效果和时间因素，将转运时间定为1 h，此时肽透过率为34%，占理想值的68%。

2.2.2 肽浓度对VPP跨膜转运的影响

图5 VPP浓度对VPP跨Caco-2细胞膜转运的影响Fig.5 Concentration dependence of VPP transport across the Caco-2 cell monolayer

由图5可知，转运时间为1 h时，VPP的透过率随VPP的初始浓度的升高而升高。VPP的转运是浓度依赖型的，随着AP侧给药浓度的增加，VPP穿过Caco-2细胞至BL侧的量随着增加，且没有达到饱和，说明VPP透过Caco-2单层细胞层以被动转运为主。为了避免饱和，结合参考文献[12]，接下来实验中VPP和IPP在AP侧给药的浓度取1 mmol/L。

2.2.3 VPP及IPP的跨膜转运机制

药物通过细胞膜有以下几种机制：通过细胞之间连接的转运、被动的穿越细胞胞质的转运、主动的载体介导的转运及药物外流和胞饮路径。被动转运是由于物质的溶解性通过细胞膜，无需膜蛋白的参与；旁路是从细胞之间的间隙进入细胞；内吞作用不必结合于细胞膜上，以囊泡内化于细胞；载体运输经细胞膜上的载体蛋白质传送，无需经由囊泡内化[15]。

图6 Wortmannin、Gly-Pro和去氧胆酸钠对VPP转运的影响Fig.6 Effects of wortmannin, Gly-Pro and sodium deoxycholate on the transepithelial transport of VPP across the Caco-2 cell monolayer

图7 Wortmannin、Gly-Pro和去氧胆酸钠对IPP转运的影响Fig.7 Effects of wortmannin, Gly-Pro and sodium deoxycholate on the transepithelial transport of IPP across the Caco-2 cell monolayer

据报道PepT1是二肽和三肽的特定转运载体[16]，Gly-Pro是肽载体PepT1的好的底物，并且能抵御住刷状缘肽酶的水解，所以Gly-Pro经常用来分析肽转运载体的作用。如果PepT1介导肽的转运，加了Gly-Pro的系统里，部分PepT1用于和Gly-Pro结合，使得作用于肽的转运载体量减少，进而导致肽转运量降低。图6显示转运1 h后，Gly-Pro对BL侧VPP有转运抑制作用，但不显著，表明肽载体可能不是VPP转运过程中的主要机制。Wortmannin是内吞抑制剂，抑制药物跨细胞过程中的内吞作用，但Wortmannin没有显著降低BL侧VPP的浓度，说明内吞不是VPP跨细胞膜的转运机制。去氧胆酸钠是旁路转运促进剂，能增强旁路转运的透过能力，去氧胆酸钠对VPP转运有显著的促进作用（P＜0.01），表明VPP主要以旁路扩散的机制被小肠上皮细胞吸收。综合图6、7得知IPP的主要转运机制与VPP相似，也是旁路转运途径。

2.2.4 VPP及IPP的外排机制

P-糖蛋白和多药耐药蛋白（multi-drug resistant protein，MRP）均为Caco-2细胞中主要的能量依赖性外排转运蛋白，通过ATP供能。P-糖蛋白可以将多种化学上不相关的内源性和外源性化合物排到细胞膜外。P-糖蛋白和MRP中的MRP2位于Caco-2细胞的AP侧，可以将细胞内药物外排至AP侧，导致药物吸收量减少，不利于吸收[17-18]。维拉帕米是P-糖蛋白抑制剂，抑制P-糖蛋白的外排作用。MK-571是MRP2的抑制剂，抑制其外排作用。叠氮化钠是ATP能量生成抑制剂，抑制能量生成。

图8 维拉帕米、MK-571和叠氮化钠对VPP转运的影响Fig.8 Effects of verapamil, MK-571 and sodium azide on the transepithelial transport of VPP across the Caco-2 cell monolayer

由图8可知，MK-571对VPP从AP侧至BL侧的转运影响不明显，而维拉帕米的有非常显著的促进作用。说明VPP在吸收过程中的外排主要是由P-糖蛋白介导的。P-糖蛋白是能量依赖性的外排泵，消耗能量，加了叠氮化钠的VPP的浓度大于没有加叠氮化钠的浓度，说明抑制住部分ATP生成，影响了外排转运蛋白起作用，验证P-糖蛋白介导了VPP的外排。

图9 维拉帕米、MK-571和叠氮化钠对IPP转运的影响Fig.9 Effects of verapamil, MK-571 and sodium azideon on the transepithelial transport of IPP across the Caco-2 cell monolayer

由图9可知，MK-571和维拉帕米对IPP从AP侧到BL侧的转运影响都不大。叠氮化钠的加入增加了BL侧IPP的浓度，说明IPP在Caco-2细胞中的转运可能存在外排泵的作用。

3 讨 论

本实验建立了Caco-2细胞模型并从细胞形态、跨膜电阻和荧光素钠通量等方面验证了该模型。微绒毛结构是Caco-2细胞模型的典型特点，与小肠细胞相似。在电镜的观察下，细胞分化良好，有紧密连接和致密的微绒毛。电阻值是离子经细胞旁间隔的流动而形成的。跨膜电阻随着培养时间增加而增大，到21 d时增至519 Ω·cm2，完全符合要求。本实验建立的Caco-2细胞模型，细胞生长具有较好的完整性，且细胞产生极性分化，在形态上与小肠上皮细胞类似，可作为模拟小肠吸收的体外模型。

由VPP和IPP的转运实验得知，VPP的跨膜转运是浓度依赖型的。肽转运载体竞争性抑制剂Gly-Pro和内吞抑制剂Wortmannin对VPP和IPP的转运影响不显著，旁路转运促进剂去氧胆酸钠对转运有明显的促进作用，旁路转运是VPP和IPP的主要转运途径。旁路转运是一种不被降解的转运途径，保证转运过去的肽是完整的[19]。旁路转运是通过细胞间的连接，是一种依赖能量的被动转运[20]。

由VPP和IPP的外排实验得知，VPP的外排过程由P-糖蛋白介导，IPP在可能存在外排泵的作用，外排作用没有VPP大，所以生物利用度高于VPP。这与以前的报道结果相一致，潘道东[1]从Lactobacillus helveticus JCM1004和Lactobacillus casei subsp. casei ATCC393制作的酸乳中分离获得了2 种肽VPP和IPP，经测定VPP和IPP的IC50值分别为8.89 μmol/L和5.17 μmol/L，说明在相同剂量下，IPP的降高血压效果比VPP强。IPP和VPP都是非极性氨基酸，IPP与VPP比较多了一个甲基，IPP和VPP外排机制的差异可能由甲基引起，将对其做进一步研究。

本实验对IPP和VPP的跨Caco-2细胞膜吸收机制的实验研究便于找出生物利用度高的抗高血压肽和其结构特征，为这些肽提高生物利用度并起到更好的抗高血压的作用提供可能。

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Establishment of Caco-2 Cell Model and Intestinal Absorption Mechanism of the Antihypertensive Peptides Val-Pro-Pro and Ile-Pro-Pro

ZHU Qian1, GUO Yu-xing1,*, PAN Dao-dong1,2, ZENG Xiao-qun2, SUN Yang-ying2, ZHOU Hui-min1
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The Caco-2 cell model, an intestinal endothelial model for transport study, was established to study the absorption mechanism of the antihypertensive peptides, Val-Pro-Pro (VPP) and Ile-Pro-Pro (IPP). The Caco-2 cell model was evaluated by morphological features, transepithelial electrical resistance and the transmittance of fluorescein sodium. We comparatively investigated the effects of transport time, peptide concentration, enhancers and inhibitors on the transport pathways and efflux mechanisms of VPP and IPP. The results showed the established Caco-2 cell model could be used to study the intestinal absorption of VPP and IPP. Paracellular diffusion was suggested to be the main mechanism for the absorption of the two antihypertensive peptides. The transports of both peptides were influenced by the efflux pump. The efflux affected VPP more than IPP. Thus, IPP showed higher bioavailability.

antihypertensive; Val-Pro-Pro; Ile-Pro-Pro; Caco-2 cell; transport

TS252.1

A

1002-6630（2014）15-0226-06

10.7506/spkx1002-6630-201415046

2013-06-24

国家自然科学基金青年科学基金项目（31101314）；江苏省自然科学基金项目（BK2011787）；

江苏省高校自然科学研究项目（13KJB550013）；浙江省自然科学基金项目（LQ12C20003）；

宁波市科技局自然科学基金项目（2012A610145）

祝倩（1989—），女，硕士研究生，研究方向为乳品科学。E-mail：853281206@qq.com

*通信作者：郭宇星（1981—），女，讲师，博士，研究方向为乳品科学。E-mail：guoyuxing1981@163.com