上皮间质转化在肝细胞癌侵袭转移中的研究进展

张 鹏(综述)，于聪慧(审校)

(1.北京军区总医院肝胆外科，北京 100700； 2.山西医科大学研究生院，太原 030001)

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国高发、危害极大的恶性肿瘤，其发病隐匿，侵袭性生长快速，大多数肝癌患者就诊时已属中晚期，手术切除率很低，术后复发率及病死率很高。有研究发现，HCC的3年复发率达50%，姑息治疗的晚期患者，5年生存率低至7%[1-2]。因此，寻找新的治疗手段非常迫切。近年来研究发现，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transiformation,EMT)是肿瘤转移的重要机制之一，EMT现象出现在原发性肝癌细胞中，并且与HCC侵袭、转移及化疗药物耐药相关[3-4]。现对EMT在HCC侵袭转移中的研究进展综述如下。

1 调控EMT的转录因子

1.1转录因子Twist调控EMT 转录因子Twist是由202个氨基酸残基组成的结合蛋白，含有高度保守的碱性螺旋-环-螺旋结构域。人类Twist基因定位于染色体7p21，包含2个外显子和1个内含子，其中外显子1具有编码功能，信使RNA序列全长1669 bp，开放阅读框长609 bp。Twist蛋白在小鼠和人之间的同源性高达96%。Twist是肿瘤细胞发生EMT，获得迁徙、侵袭及转移能力的主要诱导因子之一[5]。Twist以Twist/Mi2/NuRD蛋白复合物与上皮钙黏素的启动子区域结合，具有独立抑制上皮钙黏素的表达，上调纤维连接蛋白和神经钙黏素的表达，从而减弱细胞间连接，促进细胞侵袭及转移，最终诱导EMT[6-8]。Niu等[9]和Yang[10]报道，EMT过程的转录因子Twist在肝癌组织中高表达预示着肝癌患者更容易肝内或肝外转移。信号转导与转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)信号途径负责将细胞外的信号传递到细胞核，从而诱导靶基因转录发挥生物学效应。Zhang等[11]研究发现，Twist、上皮钙黏素的表达与活化的STAT3信号相联系，介导肝癌的侵袭与转移，磷酸化的STAT3、Twist、上皮钙黏素形成的功能信号轴(p-STAT3/Twist/上皮钙黏素)异常可能导致肝癌患者预后不良。

1.2锌指转录因子Snail调控EMT Snail是锌指转录抑制因子家族中的一员，其在脊柱动物中包括Snail和Slug两个亚家族，其中Snail基因家族包括Snail1、Snail2和Snail3。人Snail基因位于第20号染色体长臂20q13.1～q13.2。Snail和Slug均可与上皮细胞黏附分子上皮钙黏素基因启动子近端的E-box(CACGTG)序列结合下调上皮钙黏素的表达，促进EMT发生[12]。Song等[13]报道，Snail在诱导EMT发生的过程中，提高了肿瘤细胞迁徒和侵袭能力，有利于肿瘤侵袭和向远处扩散，因而导致癌症患者预后不良。Niu等[9]和Yang等[10]报道，Snail的表达也与肝癌患者的不良预后相关。Miyoshi等[14]的研究证明,在肝癌细胞中，Snail不仅抑制上皮钙黏素的表达，而且可通过调控基质金属蛋白酶的表达而增加肿瘤的侵袭转移能力。虽然有报道显示转录因子Snail高表达于肝癌中，但目前Snail在肝癌中作为EMT过程的标志的研究还比较少[15]。

1.3E盒结合锌指蛋白1/E盒结合锌指蛋白2 E盒结合锌指蛋白(zinc finger E-box-binding protein，ZEB)家族属于锌指蛋白类，包括ZEB-1和ZEB-2，ZEB-1和ZEB-2能与上皮细胞内的上皮钙黏素基因的启动子序列中E-box(CACCTC/G) 序列结合，抑制其转录，促进EMT的发生。ZEB-1可抑制多种重要的上皮分化和细胞黏附因子，包括细胞极性基因 Crumbs3(Crb3)、HUGL2(human lethal giant larvae homologue 2)和Pals1(protein associated with Lin seven 1)相关的紧密连接蛋白，从而抑制上皮钙黏素，诱发EMT[16]。Dooley等[17]的研究表明，肝细胞可被转化生长因子(trasforming growth factor，TGF)β1/Smad信号通路激活，发生EMT。目前，ZEB在EMT过程中对HCC的作用尚未见报道。

1.4同源盒基因B7调控EMT 同源盒基因B7(homebox B7，HOXB7)属同源盒基因Hox家族B族，位于第17号染色体上的一种转录调控因子，进化上有着高度保守的DNA序列，其异常表达可能与肿瘤的发生、肿瘤增殖、分化、侵袭等有关[18-19]。HOXB7通过促进碱性成纤维细胞生长因子等生长因子的分泌，介导EMT的发生，激活磷脂酰肌醇3-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白酶和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activation protein kinase，MAPK)信号通路[20-21]。有文献报道，HOXB7过表达后，MHcc97L-PcDNA3-HoxB7细胞上皮钙黏素表达减低，神经钙黏素、波形蛋白、基质金属蛋白酶2表达增高；而抑制HOXB7表达后，人高转移肝癌细胞(HCCLM3) 上皮钙黏素表达增加，神经钙黏素、波形蛋白、基质金属蛋白、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E表达降低[22-23]。上述研究表明，HOXB7可以诱导EMT的发生。Wu等[20]研究证明，细胞过表达HOXB7后发生了明显的EMT改变，细胞的侵袭和运动的能力明显增强，同时，通过裸鼠体内实验发现HOXB7可以促进肿瘤局部的侵袭能力，这可能与HCC肝内转移有关。有文献报道HOXB7在HCC患者的癌组织表达高于正常组织，且此基因高表达的患者预后差[20，24]。目前已知HOX在肝癌细胞中均异常表达，且与肿瘤的分级、分化有关[18-19]。

2 参与EMT的信号通路

2.1Notch信号通路 Notch信号通路在肿瘤的发生、浸润及转移过程中发挥着重要作用。目前已在哺乳动物发现4种Notch受体(Notch基因编码的4种跨膜蛋白)Notch1、Notch2、Notch3和Notch4和5种Notch 配体Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged1和Jagged2；Notch信号通路通过相应配体与受体结合而激活。中期因子是一种肝素结合生长/分化因子，在包括HCC在内的多种类型恶性肿瘤中高表达，直接参与肿瘤的生长、转移过程。Güngör等[25]发现其结合Notch2也可以使Notch信号通路激活。在不同的条件下，Notch信号通路可以促进癌细胞生长或抑制癌细胞生长，具有双向调控作用。目前对Notch1研究比较多，受体Notch1在肿瘤组织内可以经常被检测到；配体Jagged1的高表达与预后不良有关[26-27]。Notch1是肝癌细胞生长的抑制信号，可能与诱导癌细胞周期停滞和凋亡有关[28]。Timmerman等[29]发现，在内皮细胞中，Notch1上调Snail的表达，Snail与上皮钙黏素基因启动子结合，使上皮钙黏素的表达降低，从而促进EMT过程。Notch1过表达时可以磷酸化c-Jun氨基端激酶，进而激活c-Jun氨基端激酶-MAPK信号通道，参与诱导肝癌细胞的凋亡。Croquelois等[30]通过特异性敲除小鼠Notch1发现，Notch1的缺失后引起肝细胞持续分裂，最终发展为结节性再生性增生，这与肝癌有着密切的联系。

2.2Wnt/β联蛋白信号通路 Wnt信号通路可分为经典信号通路和非经典信号通路。Wnt配体和Frizzled家族跨膜蛋白受体结合后，可激活3条细胞内信号通路，经典信号通路：Wnt/β联蛋白信号通路；非经典信号通路：Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/c-Jun氨基端激酶信号通路。经典的Wnt/β联蛋白信号通路包括细胞外因子Wnt、跨膜受体、β联蛋白、降解复合物以及转录因子(T细胞因子/淋巴增强因子)。Zhao等[31]报道，Wnt/β联蛋白通路可以通过直接控制缺氧诱导因子1α来诱导EMT的发生。同时，β联蛋白与T细胞因子4/淋巴增强因子相互作用，刺激下游靶基因CyclinD1、c-myc、Slug、基质金属蛋白酶和vimentin等的表达，使EMT发生。Wnt/c-Jun氨基端激酶信号通路主要通过Rho家族蛋白中的RhoA和细胞分裂周期蛋白42等激活。Iwai等[32]研究发现，口腔鳞状细胞癌胞质中堆积大量β联蛋白，并且Rho家族中的细胞分裂周期蛋白42和Rac水平也增加，它们通过诱导EMT，提高癌细胞侵袭和迁移。因此，Wnt的经典和非经典通路有时可以共同诱导EMT的产生。Wolfe等[33]通过敲除小鼠类法尼醇X受体使其自发产生HCC，发现小鼠Wnt/β联蛋白信号通路明显活化。Cheng等[34]研究发现，Zeste增强子同源物2介导的遗传沉默可以激活Wnt/β联蛋白信号通路，从而导致HCC。Huang等[34]的研究发现，舒林酸可通过下调β联蛋白抑制HCC的Wnt信号通路，下调原癌基因细胞周期素D1的表达。因此，通过药物阻断Wnt信号通路进行抗肿瘤治疗是目前研究的新方向。

2.3TGF-β/Smad信号通路 Smad家族主要有3种类型：受体调节型(R-Smads)、协同作用型(Co-Smads)和抑制作用型(I-Smads)。R-Smads包括 Smad1、Smad 2、Smad 3、Smad 5、Smad 8；Co-Smads包括Smad4；I-Smads包括Smad6和Smad 7。TGF-β1是诱导EMT 的主要因子之一，是较为公认参与调节EMT的信号通路。R-Smads被TGF-β激活后与Co-Smad形成Smads2、3、4复合物，进入细胞核内调节ZEB-1、ZEB2、Snail1、Snail2等转录因子，促进EMT发生。TGF-β通过受体激活Smad通路的同时，还可激活Erk、c-Jun氨基端激酶、p38、MAPK、磷脂酰肌醇-3-激酶、三磷酸鸟苷酸等细胞因子进行Non-Smad信号通路。TGF-β通过激活Smad和Non-Smad信号通路使Snail、Smad 相互作用蛋白 1、δ-晶体蛋白增强子结核因子 1表达量增加，使抑制分化上皮钙黏着蛋白表达抑制，进而促进细胞的EMT[35]。TGF-β还可激活EMT相关的其他信号通路，如整联素、Notch和Wnt信号通路等。通过细胞系研究发现，在肝癌的发生中，TGF-β与原癌基因Ras协同促进EMT，通过激活Smad2、3，强有力地促进肿瘤的转移[36]。Battaglia等[37]对EMT的动态研究发现，起始阶段TGF-β与MAPK协同作用，维持阶段则依赖磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt通路，c-Fos是TGF-β的下游信号，对抑制肝癌转移的起负性调控作用。Zhang等[38]研究发现，地塞米松能抑制TGF诱导的EMT过程，可能阻止肿瘤转移，但该药对机体的不良反应较大。

2.4Hedgehog信号通路 Hedgehog信号通路主要包括以下成员：配体Hedgehog(存在3个同源基因：S-Hedgehog、D-Hedgehog、I-Hedgehog)、跨膜受体Ptch(Ptch1、Ptch2)和Smo、下游转录因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)。受体Ptch能与3种配体结合；配体Hedgehog与Pich结合时，解除Smo的抑制效应，激活下游的转录调节因子Gli，最终诱导目标基因表达。Hedgehog信号通路在正常肝细胞不表达[39]。Hedgehog信号通路在PLC/PRF/5、HepG2及SMMC-7721肝癌细胞株中则异常活化，主要显示Smo过度表达，且Smo/Pich比值与肿瘤大小正相关，说明Smo与肿瘤增殖密切相关。Sicklick等[40]报道，Hedgehog信号通路在低分化细胞中异常活化，用阻滞剂环巴胺阻断该通路后，肿瘤的EMT现象及肿瘤细胞迁移受限。这说明EMT发生在Hedgehog通路活化的肝癌细胞中，且与癌细胞侵袭力相关。

3 信号通路之间的联系

Sahlgren报道[41]，Hedgehog信号转导可上调Notch的配体JAG2，JAG2与Notch结合后激活Notch信号通路，进而抑制上皮钙黏素表达，诱导EMT。Xu等[42]报道，Wnt通路与TGF-β/Smad通路关系密切，通过调节Snail1因子抑制上皮钙黏素的表达，从而激活β联蛋白/T细胞因子/淋巴样增强因子1，间接导致间质细胞基因产物的表达，参与EMT的发生。

4 小 结

EMT不仅是胚胎发育过程中必需的生理机制，其在肿瘤转移和侵袭过程中也有重要作用，近年来EMT与肿瘤侵袭转移的机制研究成为热点之一。转基因模型的建立为EMT的研究提供了更科学的工具。尽管目前对于EMT机制的理解已经有了进展，但还没有研制出比较完善的针对性的靶向药物。通过对EMT过程中信号通路和转录因子的进一步了解，将对深入探讨HCC的侵袭及转移有重要意义，寻找EMT的调节因素，以及有效的阻断手法，对于HCC的诊断和治疗有重要意义。掌握HCC侵袭转移的机制及应用靶向药物治疗肝癌迫在眉睫。

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