特异性溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的研究进展

李永前(综述)，王志平(审校)

(兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，兰州 73000)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在全世界男性恶性肿瘤排行中居第六位[1]。在我国膀胱癌的发病率一直高居泌尿系统恶性肿瘤首位，且其发病率还在逐年上升，其中90%～95%为移行上皮细胞癌。目前治疗膀胱癌的效果都不令人满意。研究显示，表浅性膀胱癌经过手术化疗后复发率为20%～30%，10%～20%的患者进展为浸润性膀胱癌[2]。而浸润性膀胱癌的预后不佳，其5年生存率仅为50%[3]。随着分子生物学的发展，人们通过构建选择复制性溶瘤腺病毒载体治疗膀胱癌让人们看到了希望，在这项技术中组织特异性启动子调控溶瘤腺病毒治疗膀胱癌成为了研究热点。

1 特异性启动子调控溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的原理

溶瘤腺病毒又称为条件复制性腺病毒，是由腺病毒进行基因改造后得。溶瘤腺病毒感染肿瘤细胞后，首先突破肿瘤细胞的防御系统，进入细胞后在细胞内大量复制，导致肿瘤细胞凋亡破碎，使其内的病毒释放出来，继续作用于周围的肿瘤细胞，以此循环，直到肿瘤细胞被全部裂解，因为溶瘤腺病毒自身缺陷只能在肿瘤细胞内选择性复制，而不能够在正常细胞中复制，因此肿瘤细胞裂解完全后溶瘤腺病毒不能够再次复制，随后被免疫系统清除。由于溶瘤腺病毒具有条件复制性的特点使其能够特异性溶解和杀伤瘤细胞，而不损伤正常组织[4]。在这基础上加上特异性启动子，溶瘤腺病毒具有更好的靶向性，并且增加了溶瘤腺病毒的溶瘤作用。

1.1腺病毒 腺病毒是直径为70.90 nm的二十面体的无包膜双链DNA病毒，能通过直径为400～600 nm的肿瘤血管漏孔到达肿瘤细胞，其因具有嗜上皮细胞性(膀胱癌90%～95%是移行上皮性)、对人低毒性(安全，不良反应小)、不整合到宿主染色体(无致癌和致突变的风险)、病毒基因组发生重排较少(病毒基因稳定，不会发生致命性突变)、同时表达多个基因(能够插入几个基因使其同时表达，发挥协同作用)、容易制备高滴度病毒等优点，成为了在基因治疗中应用最广泛的载体之一[5]。

1.2溶瘤腺病毒的构建策略 目前认为腺病毒复制的必要条件是其感染的细胞从G1期进入S期。在腺病毒感染细胞后E1A最早被转录，它编码的E1A蛋白与E2F-Rb复合体中的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白结合，导致E2F-Rb复合体分离，E2F释放后促使细胞由G1进入S期，与此同时细胞的自我防御机制也被激活，p53的降解受到抑制，随着p53降解减少，p53在细胞内积聚，并与p53反应子结合激活细胞周期停滞基因和凋亡诱导基因，从而阻止细胞进入S期和诱导细胞凋亡。但是病毒早期蛋白质E1B与细胞内p53结合使之失活，使宿主细胞由G1期进入S期，保证了病毒复制周期的顺利进行[6]。由此可以看出，E1A和E1B是腺病毒在正常细胞中必不可少的条件，而在此基础上科研工作者通过改变或调控E1A和(或)E1B基因来构建相应的溶瘤腺病毒。目前构建溶瘤腺病毒的策略主要有3个：①剔除肿瘤细胞复制不需要但是正常细胞需要的基因，如p53腺病毒[5]；②用肿瘤组织特异性启动子调控腺病毒增殖所必须的基团；③改变腺病毒外壳的纤毛蛋白，达到特异感染肿瘤细胞的目的[7]。

1.3治疗膀胱癌的溶瘤腺病毒的特异性启动子 溶瘤腺病毒治疗膀胱癌时，病毒携带的目的基因不可避免地在膀胱癌外多种组织表达，杀伤膀胱癌组织之外的正常组织，因此如何解决溶瘤腺病毒的靶向性问题成为其中的关键点，组织特异性启动子解决了此类问题，它们仅在靶组织细胞中具有活性，从而使溶瘤腺病毒特异性地在膀胱癌细胞中表达，在其他组织中不表达，避免了对其他组织的不良反应。目前在研究的启动子主要有3类：①调控腺病毒中的E1A基因的启动子，如人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcript-tase,hTERT)启动子、环加氧酶2(cyclo-oxygenase 2,COX-2)启动子、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)启动子、肝素结合细胞因子(midkine,MK)启动子、人UroplakinⅡ(human uroplakinⅡ,hUPⅡ)启动子；②调控腺病毒中E1B基因的启动子，如缺氧启动子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)；③其他，如UPⅡ启动子驱动肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、ORE(Oct-3/4 response element)结合CMVmini启动子、Survivin驱动抑癌基因LRIG1启动子。

2 特异性启动子调控溶瘤腺病毒治疗膀胱癌

2.1特异性启动子调控E1A基因的腺病毒治疗膀胱癌 COX-2是一种前列腺素合成酶，高表达于多种癌前病变以及恶性肿瘤中，包括膀胱癌。Shirakawa等[8]在2004年以此构建了腺病毒AdE3-COX2-327，该病毒由COX-2作为启动子控制E1A，体外试验显示AdE3-COX2-327能够在COX-2和腺病毒受体(coxsackievims-adenovims receptor，CAR)的双表达的膀胱癌细胞5637、A549和KK47中复制并且表现出细胞毒性作用，而在表达COX-2、不表达CAR的T-24以及只表达CAR而不表达COX-2的H358、Colo320中不复制、也无细胞毒性作用，体内动物实验结果证实AdE3-COX2-327能够抑制肿瘤细胞KK47的生长。

2006年，Melquist等[9]构建了由BSP作为启动子控制E1A基因的溶瘤腺病毒Ad-BSP-E1A,对其进行研究发现Ad-BSP-E1A对BSP和CAR阳性的膀胱癌细胞敏感，感染肿瘤细胞后对细胞具有杀伤作用。MK在包括膀胱癌在内的几种肿瘤细胞内过度表达，但是在正常细胞中几乎不表达。Terao等[10]在2007年根据其特性构建了MK启动子控制E1A基因的溶瘤腺病毒Ad-MK-E1A，该研究发现Ad-MK-E1A在5637、KK47和A549三种MK高表达的细胞中比在H891和T24这两种MK低表达的细胞T24、H891中的复制能力更强；Ad-MK-E1A不能抑制H891的生长，但能抑制T-24、A549、KK47、5637肿瘤细胞的生长，抑制作用随着细胞表达MK信使RNA的增多逐渐增强。在动物模型体内，Ad-MK-E1A注入明显抑制肿瘤生长KK47。

在尿路上皮细胞中存在的糖Uroplakins蛋白是整合薄膜蛋白组中的一种，仅表达于尿路上皮，在其他组织几乎不表达，UPⅡ是其中一种，具有膀胱特异性，在膀胱移行上皮细胞癌中几乎100%表达。He等[11]构建了UPⅡ启动子控制E1A的腺病毒Ad-UPⅡ-E1A，在将重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A感染膀胱癌细胞BIU-87后应用Western blot检测细胞中EIA蛋白为阳性，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]实验表明，重组腺病毒Ad-UPⅡ-E1A明显抑制膀胱癌细胞BIU-87的生长。田俊强等[12]随后研究了一氧化氮(nitric oxide,NO)对Ad-UPⅡ-E1A转染膀胱癌肿瘤的影响，结果显示，NO能够促进溶瘤腺病毒Ad-UPⅡ-E1A转染膀胱肿瘤细胞的效率,但不同浓度NO对溶瘤腺病毒的溶瘤效果具有双向调节作用,其中低剂量的NO能够下调重组病毒E1A的表达促进肿瘤细胞增殖,高剂量的NO通过上调E1A的表达发挥溶瘤效应。

UPⅡ能表达于正常的膀胱上皮细胞，且复制能力较低。由此Wang等[13]在Ad-UPⅡ-E1A的UPⅡ启动子前面加上前列腺干细胞抗原增强子(prostate stem cell antigen enhancer，PSCAE)构建了腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A，随后转染不同组织来源细胞系并且与改造前进行对比，雄激素依赖实验和裂解细胞T-24实验结果显示UPⅡ启动子具有组织特异性，它能够使其后的目的基因仅能够高表达于膀胱癌中，PSCAE能够增强UPⅡ启动子的活性；膀胱癌雄激素受体激动剂仅在雄激素受体(androgen receptor,AR)阳性膀胱癌细胞中提高腺病毒活性，而雄激素受体阻断剂只能够阻断部分PSCAE活性；溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A可以有效裂解膀胱癌细胞T-24。AR的表达抑制E1A的表达，但是将AR和E1A融合构成E1A-AR并处于同一雄激素依赖性启动子下游后可以提高雄激素依赖性启动子的活性，增强溶瘤腺病毒的复制。Zhai等[14]构建了溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR，体外研究显示，病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR对膀胱肿瘤细胞(如EJ、5637、BIU87)有较的强杀伤作用，动物实验证实其能显著抑制裸鼠皮下膀胱癌移植瘤生长，延长荷瘤鼠的寿命。同时，Wang等[15]对溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A及Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR在小鼠体内进行安全性检测，结果显示，注射病毒的小鼠体质量、健康状况及行为都未发现异常，血液学中淋巴细胞百分比、血小板数量无明显改变，注射病毒后的小鼠体内重要脏器(如心、脑等)未出现异常，腺病毒仅在膀胱移植瘤组织内复制和表达，证实腺病毒的近期安全性。

2.2特异性启动子调控E1B基因的腺病毒治疗膀胱癌 膀胱癌细胞中hTERT转录水平升高，致使细胞端粒酶活性明显增强。HIF-1在膀胱肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达[16]。胡建鹏等[17]构建了由hTERT启动子控制E1A基因，HIF-1启动子控制E1B基因的双调控携带超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A (staphylococcus enterotoxin A,SEA)基因的肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒SG502-SEA，体外细胞实验证实携带SEA基因的hTERT/HIF双调控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌细胞内复制、增殖并表达SEA基因，且其对肿瘤细胞有明显杀伤作用。

2.3其他类型腺病毒治疗膀胱癌 朱宏建等[18]将hUPⅡ启动子和TNF-α克隆到腺病毒Ad5中，构建重组体pAd-UPⅡ-TNF，研究表明BIU-87细胞经重组腺病毒感染后可产生高水平的TNF-α,并降低BIU-87的生长速度，感染腺病毒的BIU-87培养液可抑制L929细胞的生长。裸鼠实验显示，膀胱灌注重组腺病毒48 h后,裸鼠尿液含高水平的TNF-α,4周后腺病毒组膀胱质量和体积显著低于对照组。Oct-3/4参与肿瘤的生长，在膀胱癌中大量表达，在正常细胞中检测不到。由此，Wu等[19]构建了E1B缺失腺病毒Ad.90C，该病毒由Oct-3/4反应元件和CMVmini启动子共同控制。实验结果显示，在Oct-3/4表达水平越高的细胞中Ad.9OC显示出更强的细胞溶解效应，特别是Oct-3/4阳性的转移性膀胱癌，而在正常的细胞中无不良反应。Survivin基因的表达产物Survivin蛋白具有抗凋亡作用，其在多种肿瘤中大量表达，包括膀胱癌，而在正常细胞中不表达。严泽军等[20]由此构建了腺病毒Ad-Surp-LRIG1，该病毒是将抑癌基因LRIG1导入腺病毒后在其前面加上Survivin启动子控制其增殖，随后对其进行纯化，鉴定并测定其滴度，结果显示成功构建了溶瘤腺病毒Ad-Surp-LRIG1，其可用于进一步研究。随后蒋军辉等[21]用该病毒对T24(人膀胱癌细胞株)进行转染确定其增殖能力以及是否能影响T24细胞的侵袭能力。结果显示，其在T24中能够增殖并且可使T24细胞的侵袭能力得到抑制。

3 结语和展望

自2003年以来，特异性启动子溶瘤腺病毒治疗膀胱癌取得了巨大的进步，在新病毒的探索等方面取得了巨大的成就，但是仍有些问题需要解决。①免疫问题：机体对溶瘤腺病毒的免疫清除作用影响着溶瘤腺病毒在机体内的作用，特别是治疗膀胱癌的转移病灶时该问题更加明显。②目前的研究都只是在体外的细胞实验以及鼠模型上进行，其临床效果还不得而知。③特异性启动子溶瘤腺病毒的感染能力较低，有待进一步提高，其与传统放、化疗的相互作用有待研究。④溶瘤腺病毒的安全性还有待研究，特别是长远影响，目前这方面还缺乏研究。随着科学的进步，对膀胱癌和溶瘤腺病毒的研究将更加深入，以上问题也将逐渐得到解决，特异性启动子调控的溶瘤腺病毒必将成为人类攻克膀胱癌的利器。

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