氟维司群细菌内毒素检查方法学研究

刘 琦，陆益红

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏南京210008）

氟维司群细菌内毒素检查方法学研究

刘 琦，陆益红

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏南京210008）

目的建立氟维司群原料药的细菌内毒素检查方法。方法以DMSO溶解氟维司群，再用细菌内毒素检查用水稀释，按《中国药典》2010年版（二部）附录ⅪE细菌内毒素检查法进行干扰试验；同时对DMSO溶解氟维司群的步骤进行细菌内毒素回收率试验。结果氟维司群的最大不干扰浓度为0.25 mg·mL－1，DMSO溶解液细菌内毒素回收率在100%～150%之间。结论氟维司群原料药可采用细菌内毒素检查法控制其质量。

氟维司群；细菌内毒素；干扰试验；回收率试验

氟维司群是一种新型雌激素受体拮抗剂，以乳腺癌细胞的雌激素受体为靶点，下调其作用。治疗对象为已接受抗雌激素药物（如他莫昔芬），但病情仍趋恶化的绝经后妇女，制剂剂型为注射液。相关临床研究显示疗效与阿那曲唑相当，且耐受性良好，关节疾病不良反应发生率明显降低［1～3］。为更好的控制产品质量，保证用药安全，有必要对氟维司群原料进行细菌内毒素检测。氟维司群在水中不溶，需要进行适当处理。本次研究使用DMSO进行溶解，再将溶解液进行细菌内毒素凝胶法检查，通过干扰试验和DMSO溶解液的细菌内毒素回收率试验，表明氟维司群可以采用凝胶法检测细菌内毒素。

1 试剂与药品

1.1 药品 氟维司群（连云港润众制药有限公司生产，批号：07913001、07913002、07913003）。

1.2 试剂 细菌内毒素工作标准品（WSE），规格：100 EU／支，批号：150601－201176，中国药品生物制品检定所提供；细菌内毒素检查用水（BET），规格：5 mL／支，批号：W2012－08，中国药品生物制品检定所提供；鲎试剂1（TAL1），规格：0.1 mL／支，批号：1310170，灵敏度：0.25 EU·mL－1，湛江安度斯生物有限公司提供；鲎试剂2（TAL2），规格：0.1 mL／支，批号：1402110，灵敏度：0.25 EU·mL－1L，湛江博康海洋生物有限公司提供。

2 试验方法及结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核［4］按《中国药典》2010年版（二部）附录的要求进行试验，经复核，两种鲎试剂灵敏度的测定值均在0.5～2.0λ之间，符合规定要求，结果见表1。

表1 TAL灵敏度复核结果

2.2 细菌内毒素限值（L）的确定 根据细菌内毒素限值的计算公式：L＝K／M，其中K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量。本品为原料药，参考氟维司群注射液临床用法用量：肌肉注射，一次250 mg。故K为5.0 EU·（kg·h）－1，M为4.17 mg·mL－1，则L＝1.2 EU·mg－1，经适当调整，最终确定氟维司群的细菌内毒素限值为1 EU·mg－1。

2.3 供试品有效稀释浓度的计算 目前市售鲎试剂灵敏度一般在0.5～0.03 EU·mL－1之间，按照MVD＝cL／λ的计算公式，氟维司群的对应有效稀释浓度为C0.5＝0.5 mg·mL－1；C0.25＝0.25 mg·mL－1；C0.125＝0.125 mg·mL－1；C0.06＝0.062 5 mg·mL1；C0.03＝0.031 25 mg·mL－1。

2.4 干扰预实验 将氟维司群用DMSO溶解成10 mg·mL－1的溶液，再用BET进行稀释使成0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL－1的系列溶液，记为NPC。同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，将此系列溶液记为PPC。取灵敏度为0.25 EU·mL－1的两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述NPC和PPC进行反应，每一浓度平行做2支，同时做阳性和阴性对照。结果表明氟维司群在0.25 mg·mL－1时对鲎试剂凝集反应可能无干扰作用，结果见表2。

表2 氟维司群干扰试验预试验

2.5 干扰试验 将氟维司群用DMSO溶解成10mg· mL－1的溶液，再用BET稀释成0.25 mg·mL－1的溶液。按《中国药典》2010年版（二部）附录ⅪE中的细菌内毒素检查供试品干扰试验项进行实验，试验结果表明Es均在0.5～2.0λ之间，且Et也均在0.5～2.0 Es之间，说明氟维司群浓度为0.25 mg·mL－1时对鲎试剂凝集反应无干扰作用，结果见表3。

2.6 回收率试验 为验证DMSO溶解氟维司群的过程是否对供试品中细菌内毒素含量产生影响，本次研究设计了细菌内毒素回收试验。

表3 氟维司群干扰试验

取氟维司群样品，加入细菌内毒素标准品溶液（100 EU·mL－1）适量混合成每1 mg氟维司群含细菌内毒素1 EU，加DMSO使溶解成含细菌内毒素10 EU·mL－1的溶液，作为供试品溶液，再用BET水稀释成20、40、80、160倍稀释液，按照《中国药典》2010年版（二部）附录ⅪE中凝胶半定量试验。结果显示，内毒素回收率在100%～150%之间，说明DMSO作为溶剂对样品中细菌内毒素的含量没有影响，见表4。

表4 氟维司群的DMSO溶解液细菌内毒素回收率试验

2.7 样品的细菌内毒素检查 根据以上的干扰试验和细菌内毒素回收率试验，拟定氟维司群的细菌内毒素质量标准为：取本品，用DMSO溶解成氟维司群含量为10 mg·mL－1的溶液，再用细菌内毒素检查用水稀释，依法检查［《中国药典》2010年版（二部）附录ⅪE］，每1 mg氟维司群中内毒素含量应小于0.25 EU。依此标准检验，3批样品结果均符合规定，结果见表5。

3 讨论

细菌内毒素检查凝胶法要求将供试品内的内毒素溶于水中使鲎试剂和内毒素的凝集反应能够进行，因此对于难溶性药物（包括固体和非水溶液），寻找合适的前处理方法是首要要素，文献报道的方法主要有加入助溶剂或有机溶剂进行溶解或用水萃取［5～7］。但需要注意此时不仅应考察干扰试验，还需要对有机溶剂的溶解步骤进行细菌内毒素回收率考察［8］。本次研究曾尝试使用乙腈作为溶剂，干扰试验表明供试品溶液无干扰作用，但依照前文进行细菌内毒素回收率试验时发现回收率低于50%，不能满足药典要求。

表5 氟维司群样品细菌内毒素检测结果

根据本次研究，氟维司群采用凝胶法进行细菌内毒素检查是可行的，本品限值为1EU·mL－1，按照拟定的质量标准检查，三批样品均符合规定。

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［5］吴露露，刘洋，刘琦，等.硼替佐米细菌内毒素检查方法学研究［J］.药学研究，2014，33（4）：210－212.

［6］杨先启.紫杉醇细菌内毒素检测方法的探讨［J］.安徽医药，2005，9（5）：356－357.

［7］胡容融.注射用油细菌内毒素检查方法的研究［J］.广东药学院学报，2002，18（2）：99－101.

［8］胡宇驰，李娜，周建平.十一酸睾酮注射液细菌内毒素检查方法学研究［J］.药物分析杂志，2010，30（12）：2425－2429.

Study on the determ ination method of the bacterial endotoxins in fulvestrant

LIU Qi，LU Yi-hong
（Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China）

ObjectiveTo establish the bacterial endotoxins determination method for fulvestrant.M ethodsDMSO were added to dissolve fulvestrant，then dilute the solution with pyrogen－free water.The interference testwas conducted according to the appendixⅪE of Chinese Pharmacopoeia 2010 Vol.Ⅱ，the endotoxins recovery test of DMSO solution was conduct.ResultsMaximum nondisturb concentration of fulvestrant for bacterial endotoxins test was 0.25 mg·mL－1，the endotoxins recovery of DMSO solution was100%～150%.ConclusionThe established method of endotoxins testwas feasible for fulvestrant.

Fulvestrant；Bacterial endotoxins；Interference test；Endotoxins recovery test

R927.12

A

2095－5375（2014）12－0696－003

刘琦，男，主管药师，研究方向：药物分析，E－mail：yyandlq＠hotmail.com