HPLC法测定PEG－EPO中丁二酰亚胺的残留量

庞甲佩，逄建勇，胥国立，解福生

（1.山东阿华生物药业有限公司，山东东阿252201；2.山东东阿阿胶股份有限公司，山东东阿252201）

HPLC法测定PEG－EPO中丁二酰亚胺的残留量

庞甲佩1，2，逄建勇1，2，胥国立1，2，解福生1，2

（1.山东阿华生物药业有限公司，山东东阿252201；2.山东东阿阿胶股份有限公司，山东东阿252201）

目的建立聚乙二醇重组人促红素（PEG－EPO）中丁二酰亚胺残留量测定的高效液相色谱法。方法使用高效液相色谱法，色谱柱为Shiseido Capcell PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为0.02 mol·L－1KH2PO4（pH 6.5），检测波长为210 nm，流速为0.7 mL·min－1。结果线性范围为0.08～0.8μg（r＝1），6次重复进样峰面积响应值的RSD为0.61%，平均加样回收率为100.96%。结论建立的高效液相色谱法简单、精密度良好、准确度良好，可用于PEG－EPO中丁二酰亚胺残留量检测。

聚乙二醇重组人促红素；丁二酰亚胺；高效液相色谱

人促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一种激素类糖蛋白，相对分子量为30 kD，它的功能是促进红系祖细胞增殖，使之分化为成熟的红细胞［1］。重组人促红素（rhEPO）是通过基因工程技术生产EPO，使之成本更低廉，质量更稳定。临床上重组人促红素主要应用于治疗肾功能不全所致贫血［2］和外科围术期的红细胞动员［3］等，治疗效果非常明显。

重组人促红素在人体内循环半衰期较短，临床每周注射3次。用甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯（mPEG－SBA）对重组人促红素进行修饰，两者通过稳定的共价键结合形成聚乙二醇重组人促红素（PEG－EPO）［4］。PEG－EPO在生物体内无毒性，减缓重组人促红素在体内降解速度，延长重组人促红素的半衰期，减少注射次数至每两周1次，减轻病人痛苦，并保证了药效。

在适当的反应条件下，mPEG－SBA和EPO的N末端α－氨基或赖氨酸ε－氨基反应生成mPEG－EPO及丁二酰亚胺。反应式如下：

丁二酰亚胺有一定毒性，为反应副产物，为了更好地控制药品的质量，应当被去除［5］。丁二酰亚胺作为亲水化合物和极性化合物，在常规C18柱中的保留能力很弱甚至根本不能保留，C18AQ色谱柱是专为亲水性和极性化合物具有更强的保留能力和选择性而设计的。本实验利用C18AQ色谱柱进行高效液相层析，可以实现丁二酰亚胺、PEG－EPO的分离，从而可以检测目的产物中丁二酰亚胺残留量，以更好地控制药品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695－2996高效液相色谱仪，Shiseido Capcell PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，KQ－800KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 丁二酰亚胺（上海达瑞精细化学品有限公司，批号：20120426）；KH2PO4（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110304）；mPEG－SBA（北京键凯科技有限公司，批号：ZZ079P105）；rhEPO和PEG－EPO（本公司自制）；其他为分析纯。

2 试验方法

2.1 色谱条件 流动相：0.02mol·L－1KH2PO4（pH 6.5）；检测波长：210 nm；流速：0.7 mL·min－1；柱温：（30±5）℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 丁二酰亚胺对照品溶液（0.04 mg·mL－1）

准确称取减压干燥至恒重的丁二酰亚胺（分子式C4H5NO3，分子量115.09）4.0 mg，用注射用水溶解定容至100 mL的容量瓶中，混匀，备用。

2.2.2 mPEG－SBA对照品溶液（3.0 mg·mL－1）

准确称取减压干燥至恒重的mPEG－SBA（分子量30 000）0.030 g，用注射用水溶解定容至10 mL的容量瓶中，混匀，备用。

2.2.3 mPEG－SBA和rhEPO反应溶液 按rhEPO∶mPEG－SBA质量比1∶5，准确称取减压干燥至恒重的mPEG－SBA，加入到rhEPO原液中，搅拌溶解，室温下搅拌反应2 h，用乙酸调pH 5.0，终止反应，备用。2.2.4 供试品溶液 取PEG－EPO直接进样。

3 结果

3.1 专属性考察 分别取制备的丁二酰亚胺对照品溶液、mPEG－SBA对照品溶液、mPEG－SBA和rhEPO反应溶液、PEG－EPO供试品溶液，进样10 μL，记录色谱图。从色谱图可见，丁二酰亚胺对照品溶液保留时间为7.3 min（见图1）。mPEG－SBA对照品溶液在丁二酰亚胺位置处无吸收峰（见图2），说明mPEG－SBA性质稳定，未发生降解生成丁二酰亚胺。mPEG－SBA和rhEPO反应溶液在丁二酰亚胺位置处有较强吸收峰（见图3），说明mPEG－SBA和rhEPO反应后，释放出丁二酰亚胺。PEG－EPO供试品溶液在丁二酰亚胺位置处无吸收峰（图4），说明经过纯化工艺的处理，已经去除丁二酰亚胺残留。

图1 丁二酰亚胺对照品溶液色谱图

图2 mPEG－SBA对照品溶液色谱图

图3 mPEG－SBA和rhEPO反应溶液色谱图

图4 PEG－EPO供试品溶液色谱图

3.2 线性关系考察 精密称取丁二酰亚胺对照品40 mg，置100 mL容量瓶中，加入注射用水溶解，定容至刻度，再精密吸取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入注射用水定容至刻度，摇匀，各样品精密吸取10μL，分别注入高效液相色谱仪测定。将测得的峰面积响应值为纵坐标，以丁二酰亚胺质量（μg）作为横坐标做标准曲线，线性方程为：Y＝8×106X－83 756，r＝1，表明其结果符合线性相关，丁二酰亚胺对照品在0.08～0.8μg范围与峰面积有良好的线性关系，见表1。

表1 线性关系试验数据

3.3 精密度试验 以丁二酰亚胺对照品溶液为供试品，重复进样6次，每次进样10μL，六针重复进样峰面积响应值的RSD%为0.61%，小于2%。均符合要求，表明方法的精密度良好，见表2。

表2 精密度试验数据

3.4 回收率试验 按配方量的80%、100%、120%，精密量取已知含量的供试品溶液适量，分别加入不同量的丁二酰亚胺对照品，按“2.1”项下条件测定，每个浓度平行测定3次，平均回收率为100.96%，RSD为0.87%。

3.5 样品含量的测定 取3批自制样品进行丁二酰亚胺残留量的测定，按外标法计算含量，结果均为零，未检测出丁二酰亚胺残留。

4 讨论

检测波长采用紫外扫描法（200～350 nm），得出丁二酰亚胺在210 nm处有最大吸收，故检测波长确定在210 nm。在摸索实验中曾经采用常规的C18柱，但丁二酰亚胺属于极性物质，其保留能力很弱甚至根本不能保留，不易与杂质分开检测。当采用极性的C18AQ色谱柱时，其保留时间较长，故确定使用C18AQ色谱柱进行分析。最终确定流动相为0.02 mol·L－1KH2PO4（pH 6.5）。

本公司自制3批PEG－EPO样品丁二酰亚胺残留量检测结果均为零，说明mPEG－SBA与rhEPO反应后生成的丁二酰亚胺，经离子交换层析等纯化步骤后可以完全去除，不会在PEG－EPO蛋白药物中残留，确保了患者用药的安全。

［1］Silva M，Grillot D，Benito A，et al.Erythropoietin can promote erythroid progenitor survival by repressing apoptosis through Bcl－XL and Bcl－2［J］.Blood，1996，88（5）：1576－1582.

［2］郑法雷，李明喜，单渊东，等.国产重组人红细胞生成素注射液治疗肾性贫血的疗效观察［J］.中国实用内科杂志，1998，18（12）：726－728.

［3］毕文志，娄思权，谭军，等.重组人红细胞生成素在外科围手术期红细胞动员中的作用［J］.中华医学杂志，2001，81（5）：303－305.

［4］蔡林辉，杜宏武.持续型红细胞生成素受体激活剂研究进展［J］.中国药理学与毒理学杂志，2010，24（1）：73－76.

［5］Farhad Shirini，Nader Ghaffari Khaligh.Succinimide－N－sulfonic acid：An efficient catalyst for the synthesis of xanthene derivatives under solvent－free conditions［J］.Dyes and Pigments，2012，95（3）：789－794.

Determ ination of succinim ide residual in PEG－EPO by HPLC

PANG Jia-pei1，2，PANG Jian-yong1，2，XU Guo-li1，2，XIE Fu-sheng1，2
（1.Shandong E－Hua Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Donge 252201，China；2.Shandong Dong－E E－Jiao Co.，Ltd.，Donge 252201，China）

ObjectiveTo establish a method for the determination of residual succinimide in PEG－EPO by HPLC.M ethodsHPLCmethod was used and the separation was performed on a column packed with Shiseido Capcell PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5μm）.The mobile phase was 0.02 mol·L－1KH2PO4（pH 6.5）.The detective wavelength was set at210 nm.The flow rate was 0.7 mL·min－1.ResultsThe linear range was good in 0.08～0.8μg（r＝1）.The RSD of peak area of six repeated samplingwas0.61%.The average recovery was100.96%.ConclusionThe established method was simple，high sensitive and accuratewith a high reproducibility and can be used for the determination of residual succinimide in PEG－EPO.

Pegylated recombinant human erythropoietin（PEG－EPO）；Succinimide；HPLC

R927.1

A

2095－5375（2014）12－0686－003

国家重大新药创制专项（No.2012ZX09202－031－004）

庞甲佩，男，研究方向：生物制药，E－mail：pangjiapei＠163.com