基于形态学标记及SSR标记的甜瓜主栽品种分类鉴定研究

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）

基于形态学标记及SSR标记的甜瓜主栽品种分类鉴定研究

李瑞峰 高 鹏 朱子成 栾非时*

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）

利用形态学标记、SSR分子标记技术对市场上广泛种植的甜瓜品种进行分类鉴定。利用形态学聚类分析，得到60份材料间的相似系数为0.73～0.94，在相似系数为0.74处，60份甜瓜材料被分为2类，为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜；在相似系数为0.77处，薄皮甜瓜按照单果质量、熟性、果皮底色、芳香气分为4组，实现初步分类。经过SSR标记聚类分析，得到60份材料间的相似系数为0.75～0.95，当相似系数为 0.77 时，可以将所有供试材料分为6类。利用SSR分子标记技术，为60份不同甜瓜品种构建唯一的指纹图谱。18对SSR引物，每对引物可以检测到4～11条数目不等的多态性条带，平均为8条。多态性信息含量（PIC）平均为0.71，变化范围为0.58～0.88。采用QR编码为60份甜瓜材料构建了唯一的指纹图谱。试验结果表明形态学标记对60份材料实现初步分类，SSR分子标记则能够有效地区别60份材料，并且为建立甜瓜品种的核酸指纹图谱库提供了理论数据，实现对甜瓜品种进行快速、准确的鉴定。

甜瓜；形态学标记；SSR标记；聚类分析；指纹图谱

自1981年以来，中国甜瓜产量一直稳居世界第一，在世界总产量中占据半壁江山。正是由于我国是甜瓜生产和消费第一大国，近年来中国甜瓜的市场潜力快速开发，每年都有大量的甜瓜新品种涌入市场。随着新育成品种的不断增加，骨干亲本的重复使用，新基因资源的缺乏，新育成品种的鉴定难度逐渐增大；加之当前中国甜瓜种子市场尚不够规范，一些单位受商业利益驱动掩盖或篡改品种名称，导致甜瓜市场材料普遍存在着由于同名异物或同物异名现象导致的品种真实性问题（王美荣 等，2010）。为解决甜瓜种子经营中的纠纷与市场混乱问题，有必要建立中国甜瓜品种的核酸指纹库，为甜瓜品种纯度与真实性的鉴定提供理论依据和技术支撑，保护瓜农和育种家们的利益。

由于甜瓜本身类型非常丰富，且杂交种表型性状易受环境影响，因此品种鉴定分类不能只靠田间性状。分子标记技术的发展，为品种鉴定提供了新的途径（Naito et al.，2008）。前人已将分子标记技术广泛应用于葫芦科瓜类作物，Staub等（2004）利用RAPD分子标记技术对希腊甜瓜进行了多样性研究；刘万勃等（2002）利用 RAPD 和 ISSR 分子标记技术对 37 份甜瓜种质进行了遗传多样性研究；徐志红等（2008）利用AFLP分子标记技术对31份甜瓜材料遗传多样性和亲缘关系进行了研究；Szabó等（2005）利用SSR 技术对 47 份中世纪甜瓜种质进行了分析；艾呈祥等（2006）在比较分析各试材图谱的基础上，探讨了品种指纹图谱的统计学方法，并对构建的2个甜瓜杂交种的指纹图谱进行了可信度分析，建立了适于种子检验中使用的标准SSR标记指纹图谱。宋海斌（2012）利用SSR分子标记技术对471份甜瓜材料进行真实性鉴定，构建SSR指纹代码，发现其中52份材料的指纹代码不具有唯一性。本试验利用形态学标记对60份甜瓜材料的12个表观性状进行调查记录，初步分类，同时利用SSR分子标记构建指纹图谱，以期为中国甜瓜指纹图谱库的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2012年3月至2013年10月进行。其中田间试验在东北农业大学试验实习基地24号大棚进行。将60份甜瓜材料每份取20粒饱满种子，经过8 h浸种，于28 ℃培养箱催芽，待80%种子出芽时播种于营养钵中，幼苗2～3片真叶时定植。在整枝时每株摘取幼嫩叶片混匀，放入液氮中速冻，然后置于-80 ℃冰箱中保存。待果实成熟时调查12个生物学性状。分子试验在东北农业大学园艺学院西甜瓜分子遗传育种实验室进行，主要包括材料DNA提取、SSR-PCR扩增等。

1.2 试验材料

以60份中国市场上广泛种植的甜瓜品种为试材，包括46份薄皮甜瓜，14份厚皮甜瓜（表1）。供试材料分别来自北京（9份）、甘肃（3份）、河南（2份）、黑龙江（10份）、吉林（23份）、辽宁（2份）、内蒙古（1份）、新疆（10份）。

表1 供试甜瓜材料

1.3 试验方法

1.3.1 形态学标记 在果实成熟期，每份材料随机调查10个果实的形态学性状，记载方法和标准参照《甜瓜种质资源描述规范和数据标准》（马双武和刘君璞，2006），并根据田间实际情况制定赋值标准。调查的12个性状为：全生育期、单果质量、果实硬度、可溶性固形物含量、芳香气、网纹、裂纹、肉质、果形指数、果皮底色、果肉颜色、瓤色。

质量性状的赋值，表现有无的质量性状，有记为 “1”，无记为“ 0”；表现多个类型的质量性状，可通过分级、数个数的方法统计。数量性状分析，数量性状的分级数据采用 10 级模式，即对数量性状数据进行 10 级分类，1 级＜X-2δ，10 级＞X+2δ，中间每级间隔 0.5δ，X 为均值，δ为标准差。利用NTSYS-pc 2.10e软件进行相似系数计算和基于UPGMA算法的聚类分析，并通过TreePlot模板生成聚类图。

1.3.2 SSR标记 采用改良CTAB法提取DNA（Luan et al.，2008），浓度稀释为30 ng·μL-1，-80 ℃冰箱保存备用。18对SSR核心引物序列来自同一课题组宋海斌（2012）的试验数据。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PCR反应体系及扩增条件参考朱子成等（2011）的方法。每个样品取3 µL，用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 W恒功率电泳约60 min，最终银染显色分析。

选择重复性好、谱带清晰的数据记录结果。在相同迁移位置上有条带记为“ 1”，无条带记为“ 0”。依据公式（其中fi为i位点基因频率）计算出各个引物的等位位点数及频率，然后利用Picalc 0.6软件计算各引物的多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）。利用NTSYS-pc 2.10e软件进行相似系数计算和基于UPGMA算法的聚类分析，并通过TreePlot模板生成聚类图。

1.4 指纹图谱构建

1.4.1 指纹图谱代码 参考宋海斌等（2012）的方法构建SSR指纹图谱代码。每对SSR引物可以扩增出不同的多态性条带，依据分子量从大到小的顺序记录各个条带的分子量（单位为bp，在这里略去单位bp，只记录数字），再将引物按照固定的顺序进行编号，依次为A、B、C……记录每份材料经不同的SSR引物扩增出现的条带，如果1份材料经同一引物扩增同时出现多条条带，则用“-”连接数字，这样每个品种的DNA经不同的引物扩增后将会形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列带型编号，便形成了该品种的SSR指纹图谱代码。如某品种的SSR指纹图谱代码为A215B400-305C0，则表示该品种经A引物扩增出现了分子量为215 bp的条带，经B引物扩增出现了分子量为400 bp和305 bp的2条条带，经C引物没有扩增出条带。

1.4.2 指纹图谱QR编码 应用仙居朝歌软件有限公司出品的QRCode转化工具QR精灵2.12进行编码，将各品种的名称、类型、SSR指纹图谱代码等一起录入该软件，形成指纹图谱QR编码。

2 结果与分析

2.1 形态学标记结果

图1 形态学标记聚类分析图

根据形态学标记获得60份材料的聚类分析图（图1），相似系数为0.73～0.94，在相似系数为 0.74处分为2组：第1组包括13份厚皮甜瓜，第2组包括46份薄皮甜瓜和1份厚皮甜瓜。在相似系数为0.77处，薄皮甜瓜又分为4组：第1组为华农黄皮面瓜、彩衣仙子，这2份材料都具有极强的芳香气，果皮底色都为黄色，表面有绿色的覆纹；第2组是来自甘肃的92-1，单果质量较一般薄皮甜瓜的要大；第3组是来自黑龙江的彩虹9号，较一般薄皮甜瓜的全生育期要长，在薄皮甜瓜里算晚熟品种；第4组为42份薄皮甜瓜和1份厚皮甜瓜，共43份，其中薄皮甜瓜均早熟，适应性广，可在我国各地露地种植，而1份厚皮甜瓜是来自甘肃的铁旦子，早熟。以上形态学标记聚类分析的结果，首先是基本按照传统的分类方法分为薄皮、厚皮2种，又把薄皮中的供试材料按照单果质量、晚熟、果皮底色、芳香气分类，基本符合目前我国栽培甜瓜的分类，对引种栽培具有指导意义。但由于形态标记数量有限、试验年限短等原因没有体现出厚皮甜瓜品种之间的差异，如果增加标记数量、安排多年多点试验将更有助于指导甜瓜资源在育种中的利用。

2.2 SSR标记结果

2.2.1 SSR多态性分析 将18对引物（表2）用于60份甜瓜材料的多样性分析，共得到1 229条清晰可辨条带，其中多态性条带 147 条，多态性百分率为 12.0%，扩增的 DNA 片段主要集中在 100～515 bp之间，每对引物可以检测到4～11条数目不等的多态性条带，平均为8条。多态性信息含量（PIC）平均为0.71，变化范围为0.58～0.88。以上18对引物分布于一张整合的遗传连锁图谱（ICUGI，2011 http://www.icugi.org/.）中的9个连锁群（共12个连锁群）。

表2 18对SSR核心引物信息

2.2.2 聚类分析 根据18对SSR引物的147个位点，构建了60份供试材料聚类分析图（图2），遗传相似系数的变化范围在0.75～0.95之间。当相似系数在 0.77 时，可以将所有供试材料分为6类，第1类是来自甘肃的薄皮甜瓜材料92-1；第2类是来自北京的厚皮甜瓜杂交种顺甜红帅；第3类是来自黑龙江的薄皮甜瓜彩虹9号；第4类是2份厚皮甜瓜材料，来自甘肃的铁旦子、黄河蜜2号；第5类11份材料都为厚皮甜瓜，其中棚甜301来自北京，其余10份材料来自新疆，分别为2006QT-13、2006QT-14、2006QT-15、2006QT-18、2006QT-20、伽师瓜、86-1、杂交皇后、天域1号、2006QT-23；第6类包含了剩下的44份材料，都为薄皮甜瓜。

图2 SSR标记聚类分析图

以上SSR标记的聚类分析结果结合田间性状调查分析，可将14份厚皮甜瓜分为3类：第1类的顺甜红帅与其他品种比较，明显的区别就是果肉颜色为橘红色，近似红色，可能血缘与其他甜瓜材料相差较远；第2类是来自甘肃的厚皮甜瓜铁旦子和黄河蜜2号，它们有直系的亲缘关系，在进化树上距离也最近；第3类为剩余的11份厚皮甜瓜，其中10份来自同一地区新疆，而另一份材料棚甜301为厚皮杂交种，可能是与新疆地区某些材料有血缘关系。46份薄皮甜瓜的SSR标记聚类分析结果与形态学聚类结果基本一致。通过上述结果可以看出，供试材料很明显地划分为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜两大传统分类，并且其中许多亲缘关系较近的材料也都聚类在一起，如来源于甘肃的铁旦子和黄河蜜2号聚在了一起，来源于新疆、亲缘关系近的10份材料也都聚在一起。结果表明，SSR聚类结果能较好地反映供试材料的亲缘关系。

2.3 指纹图谱的构建

2.3.1 指纹图谱代码 60份供试材料分别经过18对SSR引物扩增后，依据本试验之前所设计好的指纹代码构建方法，为每份材料都建立了唯一的能够区别于其他供试材料的SSR指纹图谱代码（表3）。

表3 供试甜瓜材料及其SSR指纹图谱代码

在SSR分子标记中，每份材料由1对引物扩增出0～3条条带，经过统计，所有供试材料由18对引物扩增后，出现条带最多的有4个品种：联华香雪、金玉1号、黄河蜜2号、92-1，都含有26条条带；出现条带最少的是丰甜4号，共含有16条条带，每份供试材料由18对引物扩增出16～26条数目不等的条带，平均为20.48条。

2.3.2 指纹图谱QR编码 利用QRCode转化工具QR精灵2.12对所有供试材料进行编码，为每份材料均构建了1份指纹图谱QR编码（图3），其中包含了品种名称、类型、来源地、SSR标记的指纹代码等信息。如图3-A中包含以下信息：名称，金香蜜；类型，薄皮杂交种；来源地，北京；SSR指纹图谱代码，A350-215B440C140D250-215E265F380-350G420H245I240J220-195K250-200L340-300M295N245O220P190Q190R115。

图3 部分甜瓜品种指纹图谱QR编码

3 结论与讨论

从以上试验结果可以看出，形态标记与SSR标记聚类结果大部分是一致的。两者都按照薄皮甜瓜、厚皮甜瓜传统方法对60份甜瓜材料进行分类。在形态学分类中，薄皮甜瓜根据单果质量、熟性、果皮底色、芳香气分类；厚皮甜瓜基本聚在一起，只有1份材料可能由于早熟被分开。SSR标记则将厚皮甜瓜区分开，且明显具有原产地相同的材料相似系数高，聚类分析首先被聚在一起的趋势；薄皮甜瓜除了其中2份材料分别聚为一类，与形态学标记一致，剩余的大部分薄皮甜瓜聚为一类。

形态学标记与SSR标记在育种过程运用时各有长处，两者结合使用更有利于种质资源研究的深入，进而鉴定种子的真实性，辨别是否存在同物异名、同名异物现象。形态学标记简便易行，对大多数栽培品种的分类结果与品种的生态适应性一致（金基石，2001）。SSR标记用于检测差异性不大的杂交类型的甜瓜种质之间的分类非常有效，通过绘制 DNA 指纹图谱可以非常准确地鉴定种质之间的差异，并可以快速地进行品种鉴定。

本试验利用形态学标记对供试材料进行了初步分类，但形态学标记易受环境影响，如果只是一年试验，则数据可能会有误差，故应增加多年、多点试验，效果会更好。SSR分子标记构建的甜瓜指纹图谱代码，如同人的指纹，都是独一无二的。但这份指纹图谱代码仅仅是DNA分子标记数据的数字化，包含的信息量有限，检测时效率不高。另一种指纹图谱QR编码，包含的信息量大，包含名称、类型、来源地及指纹代码，检测非常方便，只要QR编码扫描工具扫描就可解码，得到这个品种录入的信息，非常简便地获取品种的“指纹”。这些优点为甜瓜品种的鉴定提供了有利条件。另外，QR编码可以容纳的信息量非常大，为了更准确地进行品种鉴定，还可以加入一些经过多年多点试验的、比较准确的表观性状，如果皮底色、果肉颜色、糖度、单果质量等。这样的信息包含表型性状信息和分子数据，将使甜瓜品种鉴定更加全面。

艾呈祥，余贤美，马国斌，刘庆忠．2006．甜瓜杂交种SSR指纹图谱的构建．果树学报，23（3）：415-419．

金基石．2001．薄皮甜瓜主要种质资源遗传多样性的研究〔硕士论文〕．哈尔滨：东北农业大学.

刘万勃，宋明，刘富中，王怀松．2002．RAPD和ISSR标记对甜瓜种质遗传多样性的研究．农业生物技术学报，10（3）：231-236．

马双武，刘君璞．2006．甜瓜种质资源描述规范和数据标准．北京：中国农业出版社：3-9.

宋海斌．2012．甜瓜品种（系）DNA指纹图谱库的构建与遗传多样性分析〔硕士论文〕．哈尔滨：东北农业大学．

宋海斌，崔喜波，马红艳，朱子成，栾非时．2012．基于SSR标记的甜瓜品种（系）DNA指纹图谱库的构建．中国农业科学，45（13）：2676-2689.

王美荣，许勇，詹永乐，郭绍贵，任毅，宫国义，张海英．2010．厚皮甜瓜品种组合SSR指纹图谱构建．中国农学通报，26（20）：47-51.

徐志红，徐永阳，刘君璞．2008．甜瓜种质资源遗传多样性及亲缘关系研究．果树学报，25（4）：552-558.

朱子成，高美玲，高鹏，栾非时．2011．甜瓜结实花初花节位QTL分析．园艺学报，38（9）：1753-1760.

Luan F S，Delannay I，Staub J E．2008．Melon（Cucumis melo L.）diversity analysis provide strategies for genetic improvement and evidentiary support of domestication patterns．Euphytica，164：445-461.

Naito Y，Suzuki S，Iwata Y，Kuboyama T．2008．Genetic diversity and relationship analysis of peanut germplasm using SSR markers．Breeding Science，58（3）：293-300．

Staub J E，López-Sesé A I，Fanourakis N．2004．Diversity among melon landraces（Cucumis melo L.）from Greece and their genetic relationships with other melon germplasm of diverse origins．Euphytica，136：151-166.

Szabó Z，Gyulai G，Humphreys M．2005．Genetic variation of melon（C．melo）compared to an extinct landrace from the Middle Ages（Hungary）I．rDNA，SSR and SNP analysis of 47 cultivars．Euphytica，146：87-94.

Studies on Classification and Identification based on Morphological Markers and SSR Markers for Elite Varieties of Cucumis melo L.

LI Rui-feng，GAO Peng，ZHU Zi-cheng，LUAN Fei-shi*

（College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Studies on classification and identification of 60 melon（Cucumis melo L.）materials were conducted by SSR marker and Morphological marker. Based on morphological cluster analysis the genetic similarity coefficient of the 60 materials ranged from 0.73-0.94，and at the genetic similarity coefficient of 0.74 these melons could be classified into 2 categories：Cucumis melo ssp. conomon and C. melo ssp. melo. Cucumis melo ssp. conomon could be subdivided into 4 groups，which are preliminarily classified by single fruit weight，peel color，aroma，maturity. The result of SSR cluster analysis showed that the genetic similarity coefficient of the 60 accessions ranged from 0.75-0.95. Also，the test materials could be divided into 6 categories at the genetic similarity coefficient of 0.77. 18 pairs of the SSR primers could detect 4-11 polymorphic bands with an average of 8 bands. The average polymorphism information content（PIC）was 0.71 with the changing range of 0.58-0.88. The fingerprinting effectively distinguished the 60 materials and every accession had unique fingerprinting using QR code.

Melon（Cucumis melo L.）；Morphological marker；SSR marker；Clustering analysis；Fingerprinting

李瑞峰，女，硕士研究生，专业方向：甜瓜分子育种，E-mail：lrf0208@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：栾非时，女，教授，博士生导师，专业方向：西甜瓜分子遗传育种，E-mail：luanfeishi@sina.com

2014-01-06；接受日期：2014-03-14

国家西甜瓜产业技术体系—分子育种岗位项目（CARS-26-02）