野生赤芍和栽培芍药的芍药苷、苯甲酸含量测定

胡媛，赵梓辰，杨昌林，刘友平

赤芍为历版《中国药典》收载品种，来源于毛茛科植物芍药Paeonia lactifioraPall. 或川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根。味苦，微寒，归肝经，清热凉血，散瘀止痛，用于热入营血，温毒发斑，吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛经，癓瘕腹痛，跌扑损伤，痈肿疮疡，为临床常用中药材。芍药有野生品和栽培品，传统认为赤芍以野生的芍药根晒干入药为好；而栽培芍药一般去皮后煮熟，暴晒至干，作白芍药用。但由于近年野生芍药资源的急剧下降，市场上出现栽培芍药的细小根直接干燥作为赤芍药用的现象，其科学性和合理性还有待深入研究。

现代研究表明，单萜苷中的芍药苷是芍药的主要有效成分[1～3]，具有抗自由基损伤、抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性、抗炎、镇痛等作用，而芍药中的苯甲酸[4～5]，会增加肝脏的解毒负担，摄入一定量会产生不良反应，其对机体有致突变作用，可能导致非免疫型接触性荨麻疹及非免疫直接接触反应，如风疹、红斑、瘙痒症等，被认为是芍药中的有害成分，实验研究还发现，由于芍药中的单萜苷类成分含有苯甲酰基，在一定条件下可水解为大量的苯甲酸。为了客观检测赤芍商品药材中芍药苷与苯甲酸的真实含量，本实验采用RP-HPLC法同时测定34批芍药药材（22批来源于栽培芍药，12批来源于野生芍药）中芍药苷与苯甲酸的含量，为栽培芍药当赤芍药用的合理性提供科学依据。

1 材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪岛津LC10-ATVP，CLASS-VP工作站；色谱柱为Hypersil ODS（200mm×4mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司)；电子分析天平BP211D（十万分之一），BP121S（万分之一）（德国Sartouris股份有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BUG25-12超声波清洗机（上海必能信公司）。

1.2 材料与试剂

芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110736-200732）；苯甲酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100419-200301）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；其余试剂为分析纯。

1.3 药材

赤芍药材样品编号及来源见表1。

表1 赤芍药材样品收集和鉴定表

SYZ-19 P.lactifiora Pall. 四川中江县籍庆镇 根茎(自采)SYZ-20 P.lactifiora Pall. 四川中江县石泉乡 根茎(自采)SYZ-21 P.lactifiora Pall. 四川中江县石泉乡 根茎(自采)SYZ-22 P.lactifiora Pall. 成都中医药大学峨眉校区GAP基地 根茎(自采)

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液的制备 取芍药苷和苯甲酸对照品各5 mg、2.5 mg，精密称定，分别置10 mL、25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得含芍药苷0.504 mg．mL-1和含苯甲酸0.105 mg．mL-1的溶液作为对照品储备液。从中分别精密量取芍药苷与苯甲酸对照品储备液各5 mL、2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得含芍药苷252 μg．mL-1和含苯甲酸21 μg．mL-1的混合对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取赤芍细粉（过三号筛）0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水-甲酸（95∶5）10 mL，称重，浸泡2 h，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，放冷，用水-甲酸（95∶5）补足减失的重量，过滤，收集续滤液，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱Hypersil-ODS C18(4.6×200 mm,5 μm)，流动相甲醇-0.1%磷∶酸水（27∶73），流速1.0 mL．min-1，柱温30 ℃，检测波长230 nm。在上述条件下，芍药苷与苯甲酸完全分离，色谱图见图1、图2。以芍药苷峰计算理论塔板数为8000。

图1 芍药苷与苯甲酸混合对照品HPLC色谱图

图2 芍药样品测定芍药苷与苯甲酸含量HPLC色谱图

2.3 线性关系考察

取混合对照品溶液，采用逐级稀释法，得含芍药苷15.75 μg．mL-1、31.5 μg．mL-1、63 μg．mL-1、126 μg．mL-1、252 μg．mL-1和含苯甲酸1.3125 μg．mL-1、2.625 μg．mL-1、5.25 μg．mL-1、10.5 μg．mL-1、21 μg．mL-1对照品溶液，按照上述色谱条件分别进样20 μL，记录峰面积。以峰面积（A）为纵座标，芍药苷（或苯甲酸）（μg）为横座标，进行回归，得芍药苷回归方程y=1×106x-23310，R2=0.9997，芍药苷在0.315～5.040 μg．mL-1内与峰面积呈良好的线性关系；得苯甲酸回归方程y=5×106x+8881.4，R2=0.9998，苯甲酸在0.02625～0.42000 μg．mL-1内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液20 μL，重复进样6次，分别测定峰面积，结果表明芍药苷的RSD为1.21%，苯甲酸的RSD为1.56%，用本方法进样精密度良好。

2.5 稳定性试验

取芍药供试品溶液，分别于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h测定峰面积，结果表明芍药苷的RSD为2.01%，苯甲酸的RSD为2.27%，供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取芍药6份，制备供试品溶液，照上述色谱条件进行实验，记录色谱图，并计算含量，结果表明芍药苷平均质量分数为59.80 mg ．g-1，RSD为2.52%；苯甲酸的平均质量分数为0.504 mg．g-1，RSD为2.74%，该方法重现性良好。

2.7 加样回收试验

取芍药6份，每份0.05 g，精密称定，两份一组，各组分别加入芍药苷对照品溶液（1.274 mg．mL-1）2.0 mL、2.4 mL、2.8 mL，苯甲酸对照品溶液（0.0250 mg ．mL-1）0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，挥去溶剂，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备中从“置具塞锥形瓶中…”开始制备供试品溶液，依法测定，记录色谱图，计算回收率，结果见表2、表3。

表2 芍药苷加样回收试验结果

表3 苯甲酸加样回收试验结果

3 0.0501 0.025 0.025 0.051 103.06 102.15 2.73 4 0.0503 0.025 0.025 0.051 103.07 5 0.0502 0.025 0.030 0.056 103.09 6 0.0504 0.025 0.030 0.054 96.54

结果表明：芍药苷平均回收率为97.02%，RSD为1.34%，苯甲酸平均回收率为102.15%，RSD为2.73%，该方法准确度良好。

2.8 样品含量测定

分别取供试品溶液及混合对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表4。

表4 34批赤芍商品药材中芍药苷与苯甲酸含量测定结果(n=2)

由上表可知，上述34批芍药商品药材中有33批药材符合《中国药典》2010版的规定（芍药苷含量＞18.0 mg．g-1）。栽培芍药和野生芍药的芍药苷含量采用SPSS 19.0统计软件中非参数检验（两样本秩和检验，Mann-Whitney U），得到P=0.007＜0.05，说明二者存在显著性差异；对栽培芍药和野生芍药的苯甲酸含量采用SPSS 19.0统计软件中非参数检验（两样本秩和检验，Mann-Whitney U），得到P=0.000＜0.05，说明二者存在显著性差异。

3 讨论

本试验采用HPLC法同时测定芍药药材中芍药苷与苯甲酸含量，该法重复性好，可靠性强，对栽培的芍药当赤芍药用的合理性研究具有重要意义。对实验结果进行分析发现，试验采用的22批栽培芍药中有21批药材符合《中国药典》2010版的规定（芍药苷含量＞18.0 mg．g-1），说明栽培芍药当做赤芍药用具有一定的可行性和合理性，但是栽培芍药和野生芍药的芍药苷和苯甲酸含量都存在显著性差异，说明栽培芍药和野生赤芍在一定程度上不具有质量等同性，栽培芍药代替野生芍药当做赤芍药用还需要结合其他化学成分和药理作用的比较进行深入研究。

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