沙葱不同部位提取物总黄酮含量及其体外抗氧化、抗菌活性研究

萨茹丽，木其尔，王翠芳，包玲玲，敖长金

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

沙葱不同部位提取物总黄酮含量及其体外抗氧化、抗菌活性研究

萨茹丽，木其尔，王翠芳，包玲玲，敖长金*

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

以沙葱花、叶、秆提取物为对象，研究沙葱不同部位提取物中总黄酮含量、还原能力、清除DPPH自由基能力、体外清除羟基自由基能力以及体外对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和沙门氏菌的抑菌作用。结果表明：沙葱不同部位提取物总黄酮含量最高的为沙葱叶提取物，且各提取物均有一定的体外抗氧化与抗菌作用，其中沙葱叶提取物体外抗氧化及抗菌活性较好，对DPPH自由基的清除率可达52.2%、对羟基自由基的清除率可达84.4%。

沙葱提取物，总黄酮含量，体外抗氧化活性，体外抗菌活性

沙 葱（Allium Mongolicum Regel）在 蒙 古 语 中 称之为“胡穆利”，学名“蒙古韭，为百合科，葱属植物[1]。沙葱营养成分丰富，所含氨基酸与微量元素种类齐全[2]，其嫩叶的营养价值最高且味道鲜美，是草原人民餐桌上常见的菜肴，也是牧畜喜爱的优良牧草。多项研究表明沙葱中所含有的特殊天然成分具有良好的抗氧化[3-5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、免疫调节[8-9]、提高畜产品 品 质[10-11]等 生 物 功 效[6-11]，但 对 于 沙 葱 不 同 部 位的生物活性成分以及生物功效的相关研究报道却较为少见。目前已有的研究认为，植物的乙醇提取物中含有较多的黄酮类化合物。黄酮类化合物是一类广泛存在于瓜果、蔬菜以及中草药中的活性成分，也是体外抗氧化的主要有效成分[12-14]，在体外对DPPH自由基、羟基自由基具有较好的清除作用。也有研究表明，黄酮类化合物对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌等致病菌具有一定的抑制作用[15-16]。本研究以沙葱花、叶、秆为对象，探究了沙葱不同部位提取物的还原能力、体外清除DPPH自由基和羟基自由基能力以及体外对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和沙门氏菌的抑菌作用，旨在探讨沙葱不同部位提取物的体外抗氧化与抗菌能力，为沙葱的开发与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙葱嫩叶、花蕾以及粗秆 均采自内蒙古鄂尔多斯市鄂托克前旗天然牧场（经内蒙古农业大学生态与环境学院鉴定）；DPPH、BHT、DMSO、MTT 均购自Sigma公司；芦丁标准品 贵州迪大科技有限责任公司；其他化学试剂 均为国产分析纯；营养琼脂培养基，营养肉汤培养基，大肠杆菌（ATCC-25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC-25923）、绿脓杆菌（27853）、和沙门氏菌（50096） 所用菌种均由内蒙古医科大学病原微生物实验室提供。

旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Synergy H4多功能酶标仪，电子分析天平 Sartorius；超声波清洗机 长沙惠一仪器有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机 Millipore公司；恒温培养箱 南京实验仪器厂；超净工作台 苏州净化仪器厂；微量振荡混匀机 南通无线电三厂；平板离心机 Eppendorf公司；高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 试验原料的预处理 将样品洗净、65℃烘干，粉碎，过80目细筛。按1∶10的比例加入石油醚进行脱脂脱色处理，挥干石油醚后干燥贮存备用。

1.2.2 提取物的制备 准确称取1g预备粉末置于150mL三角锥形瓶中，加入70%乙醇50mL，混匀后置于超声波清洗机内超声提取。超声条件为：240W、提取时间20min、提取温度40℃、提取次数1次。将所得产物经2000r/min离心10min后弃掉沉淀，收集上清后，置于旋转蒸发仪上60℃浓缩至10mL左右后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可得到粉末状的总黄酮。使用前称取100mg冻干粉末用75%乙醇定容至10mL即为10mg/mL总黄酮原液，经0.22μm滤膜过滤除菌备用。试验分别就沙葱花、叶以及秆进行提取，每组五个重复。

1.2.3 沙葱不同部位黄酮含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 分别配制浓度为0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42、0.48、0.54、0.60mg/mL的芦丁标准品溶液，使用1.2.3.2所示测定方法测定不同浓度标准溶液在510nm处的吸光值，参照赵春艳方法绘制标准曲线[8]。

1.2.3.2 样品中黄酮含量的测定 从各组样品原液中分别吸取300μL于2mL EP管中，加入20%的NaNO2溶液30μL，充分混匀后反应3min；加入40%Al（NO3）3溶液40μL，充分混匀并反应3min后加入100μL的20%NaOH溶液，充分混匀后反应10min。从每管吸取200μL体积样品于96孔板内，酶标仪测定其510nm处吸光度。

1.2.4 沙葱不同部位提取物抗氧化能力的测定

1.2.4.1 总还原能力的测定 在试管中分别加入2.5mL pH为6.6的磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液），再加入0.01g/mL的铁氰化钾溶液1mL、混匀后加入待测样品1mL后充分摇匀，50℃水浴保温静置20min，待冷却后迅速加入0.1g/mL的三氯化铁溶液1mL，混匀静置10min后于700nm处检测吸光值，总还原能力以吸光度值表示[17]。

1.2.4.2 体外清除DPPH自由基的能力 准确称取7.88mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得浓度为2×10-4mo1/L的DPPH原液，避光保存（0～4℃）。分别取100μL的沙葱不同部位乙醇提取液与2×10-4mol/L DPPH液100μL于96孔板中，中速混匀5min，避光反应30min后测定525nm处吸光度（Ai）。与此同时也分别测定100μL 95%乙醇加100μL DPPH后 的 吸 光 度（Ac）和 100μL 待 测 液 加 100μL 95% 乙 醇后的吸光度（Aj）。

1.2.4.3 清除羟基自由基的能力 按照南京建成试剂盒操作说明执行。

1.2.5 体外抑菌试验 抑菌圈直径的测定与最小抑菌浓度的检测试验方法参照乌仁张嘎[5]方法。

MTT法检测沙葱总黄酮的体外抑菌率的试验方法参照许颖[17]方法。

1.3 数据分析

数据处理采用Excel软件进行初步整理后使用SAS9.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 沙葱不同部位所含黄酮类化合物浓度

图1 芦丁标准曲线的绘制Fig.1 Rutin standard curve

如图1所示，以芦丁为标准品，在510nm波长处测得的吸光度为纵坐标，芦丁标准品浓度为横坐标，使用Excel软件进行标准曲线的绘制，得出芦丁标准曲线。所得标准曲线回归方程为y=3.9038x+0.3515（R2= 0.9998）。依据此回归方程，测定沙葱不同部位总黄酮的吸光度，计算黄酮浓度。

表1 沙葱不同部位总黄酮中黄酮类物质的含量Table 1 Total flavonoids content of allium mongolicum regel different part extraction

由表1可以看出，沙葱叶中黄酮浓度达到4.891mg/g。沙葱秆中的黄酮浓度为2.144mg/g，沙葱花的黄酮浓度显著（p＜0.01）少于其他两组，仅为1.921mg/g。由此可以看出，在沙葱叶中所含黄酮浓度最高。

2.2 沙葱不同部位提取物还原能力的测定

如图2结果所示，沙葱不同部位提取物均有一定的还原能力，且试验结果显示其还原能力与提取物的质量浓度具有剂量效应关系，即试验样品原液浓度在0.5mg/mL至3mg/mL的范围内，随着样品浓度的升高其还原能力也呈现出逐渐升高的趋势。在浓度较低的情况下试验各组提取物还原能力显著（p＜0.01）低于对照BHT组，但随着浓度升高至3mg/mL时试验各组还原能力逐渐升高此差异呈现逐渐缩小的趋势。图2中显示，当各组浓度相同时，沙葱叶提取物的还原能力高于沙葱秆与花组的还原能力（p＜0.05）。

图2 沙葱不同部位提取物还原能力Fig.2 Reducing capacity of extraction from allium mongolicum regel different part

2.3 沙葱不同部位提取物清除DPPH自由基的能力

图3 清除DPPH自由基的结果Fig.3 Result of the clearance rate of DPPH free radical

试验结果如图3所示，沙葱各部位提取物的清除DPPH自由基的能力显著低于相同剂量的对照组芦丁及BHT。沙葱不同部位提取物的清除DPPH自由基的能力随着浓度的增加呈增加的趋势，其中沙葱叶中所得提取物的清除DPPH自由基的能力显著高于其他部位的提取物清除DPPH自由基的能力（p＜0.01）。当样品浓度达到0.5mg/mL时沙葱叶提取物在体外的环境下可以有效地清除DPPH自由基，清除率均为52.2%，与其他各组差异显著（p＜0.01）。沙葱花提取物对DPPH自由基的清除率为37%显著低于沙葱叶组与沙葱秆提取物的体外清除有机自由基DPPH的能力（p＜0.01）。

2.4 沙葱不同部位提取物体外清除羟基自由基的作用

图4 体外清除羟基自由基的作用研究Fig.4 Result of clearance rate of hydroxyl free radicals

由图4中的结果可看出，芦丁体外清除羟基自由基能力最强。当浓度在0.1mg/mL至0.5mg/mL时，沙葱不同部位提取物在体外对于羟基自由基的清除率与提取物浓度具有剂量效应关系，即浓度越高，清除羟基自由基的能力越强。试验结果显示沙葱不同部位的提取物在体外环境下对羟基自由基的作用中，当各组浓度为0.5mg/mL时沙葱叶中得到的提取物对羟基自由基的抑制作用较强（清除率为84.4%），而此时沙葱花提取物的清除率为68.2%，沙葱秆提取物的体外清除羟基自由基的清除率为64%，与沙葱叶提取物体外清除羟基自由基的能力相比其差异显著（p＜0.01）。

2.5 沙葱不同部位提取物体外抑菌作用

2.5.1 琼脂扩散法测定沙葱提取物体外抑菌效果 实验判定标准为最小抑菌圈直径（以下以大写字母D表示）D≤8mm为不敏感，8mm＜D≤13mm为低度敏感，13mm＜D≤19mm为中度敏感，D＞19mm为高度敏感。结果如表2所示：沙葱叶提取物的体外抑菌效果较其他两个试验组具有明显的抑菌作用，对沙门氏菌的抑菌环直径可达13.6mm，为中度敏感；对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径为9.3mm，为低度敏感。

表2 沙葱不同部位提取物的体外抑菌作用Table 2 The effect of the antibacterial test of extraction from allium mongolicum regel different part

2.5.2 最小抑菌浓度的测定 使用微量稀释法测定沙葱不同部位提取物最小抑菌浓度。结果如表3所示，沙葱不同部位提取物对绿脓杆菌无显著抑制作用，沙葱花中和沙葱秆提取物对沙门氏菌的最小抑菌浓度均为5mg/mL；沙葱叶提取物对绿脓杆菌无显著抑制作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5mg/mL、对沙门氏菌的最小抑制浓度为1.25mg/mL。由此表明，沙葱叶提取物在体外对沙门氏杆菌具有较好的抑菌作用。

表3 沙葱不同部位提取物最小抑菌浓度的测定Table 3 Minimal inhibitory concentration of extraction from allium mongolicum regel different part

2.5.3 MTT法检测沙葱不同部位提取物的体外抑菌率 图5为MTT法检测沙葱不同部位提取物的体外对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和沙门氏菌的抑菌率。结果显示随着提取物浓度的升高其抑菌能力也有增高趋势。其中对于大肠埃希氏菌的抑制作用由强到弱的顺序是叶＞秆＞花，且各组抑制率差异显著（p＜0.05）。对于绿脓杆菌，沙葱各部位提取物的抑制率差异不显著（p＞0.05），各组抑制率显著低于对照组（p＜0.05）。对于金黄色葡萄球菌，沙葱花与沙葱叶中提取物（组间差异不显著，p＞0.05）的抑制率均高于沙葱秆提取物的抑制率，且差异显著（p＜0.05）。对于沙门氏伤寒菌，随着提取物浓度的升高，各组抑制率呈上升的趋势，且差异显著（p＜0.05），其中沙葱叶提取物对沙门氏伤寒菌的抑制作用最强，抑制率显著高于沙葱花与沙葱秆提取物的抑制率（p＜0.05）。由此来看沙葱不同部位提取物在体外条件下对供试菌种均有一定的抑制作用，其中对沙门氏伤寒菌的抑制作用最为显著。

图5 沙葱不同部位提取物体外抑菌作用的研究结果Fig.5 The effects of the antibacterial test of extraction from allium mongolicum regel different part

3 结论

近年来对于沙葱的研究主要集中在沙葱叶上，对于沙葱花以及沙葱秆的研究较少，本次实验以沙葱不同部位提取物为研究对象比较沙葱花、叶、秆提取物的抗氧化与抗菌活性。结果表明沙葱不同部位提取物中沙葱叶提取物具有较强的体外还原能力、其体外对有机自由基DPPH·的清除率可达52.2%、对羟基自由基的清除率可达84.4%，显著高于沙葱花和沙葱秆提取物的抗氧化能力。同时在沙葱叶提取物中黄酮类物质含量也最高。研究表明，黄酮类化合物对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌等致病菌具有一定的抑制作用[18-21]。本次实验证明沙葱不同部位提取物均具有一定的抗菌活性，其中沙葱叶提取物的抗菌活性显著高于其他两组，对供试菌中沙门氏伤寒菌的抑菌作用较强，其抑菌圈直径达13.6mm、最小抑菌浓度为1.25mg/mL。由此来看在相同的提取条件下沙葱不同部位提取所得的提取物中，黄酮含量不同，活性也不同。其中以沙葱叶中的黄酮含量最多，抗氧化活性与抗菌活性也较好。在后期的研究中可以使用沙葱叶作为研究对象进行沙葱总黄酮的提取，并进一步研究发掘沙葱总黄酮的其他生物功效。

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Effect of the different parts of Allium Mongolicum Regel extraction’s total flavonoids content and antioxidant，antibacterial effects in vitro

SA Ru-li，MU Qi-er，WANG Cui-fang，BAO Ling-ling，AO Chang-jin*
（College of Animal Science，Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot 010018，China）

The antioxidant effects and antibacterial effects of extraction from different parts of Allium Mongolicum Regel were studied.The total reducing capacity ，the scavenging abilities on DPPH radicals ，hydroxyl radicals and antibacterial activity were studied.The results showed that extraction of allium mongolicum regel leaves had the significant scavenging effects on DPPH radicals and hydroxyl radicals，inhibition ratio was 52.2%and 84.4% ， extraction from allium mongolicum regel leaves had the significant antibacterial effect to Salmonella typhoid.

Allium Mongolicum Regel extraction；total flavonoids content；anti-oxidation ability；antibacterial ability

S816.11

A

1002-0306（2014）22-0124-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.019

2014－03－11

萨茹丽（1986-），女，在读博士研究生，研究方向：动物营养与畜产品品质。

* 通讯作者：敖长金（1962-），教授，研究方向：动物营养与畜产品品质。

国家自然科学基金（31260558）。