张 超
(山东中医药大学药学院,山东济南250355)
HPLC法测定市售蒺藜饮片中3种黄酮苷元的含量
张 超
(山东中医药大学药学院,山东济南250355)
目的建立高效液相色谱法同时测定蒺藜饮片中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法。方法用Kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,甲醇-0.1%甲酸溶液(47∶53)为流动相,检测波长368 nm,流速1.0 mL·min-1,柱温25℃。结果槲皮素、山柰素和异鼠李素分别在0.58~29.0、0.292~14.6、0.248~12.4μg·mL-1范围内呈良好线性关系(r>0.999 7),平均回收率分别为100.91%、99.44%、99.20%,RSD分别为1.91%、1.85%、1.73%。结论该方法简便、快速、准确度高,可为蒺藜饮片的质量控制和炮制研究提供参考依据。
蒺藜;槲皮素;山柰素;异鼠李素;高效液相色谱法
蒺藜为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实,具有平肝解郁,活血祛风,明目,止痒的功效。历版药典均有收载,《中国药典》2010年版(一部)对蒺藜药材和饮片的质量控制仅有性状、鉴别、检查项,还未有相关指标成分的含量测定项。蒺藜主要含有甾体皂苷类、黄酮类、生物碱、多糖等化合物[1],其中,黄酮类主要是以槲皮素、山柰素、异鼠李素为苷元的黄酮苷类化合物,已有蒺藜药材水解产物黄酮苷元含量测定的相关报道[2,3],但目前市售蒺藜饮片多为炒制,还未见相关炒蒺藜中黄酮苷元含量测定的报道。本研究建立了HPLC同时测定蒺藜饮片中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法,为控制蒺藜炮制品的质量,探讨蒺藜的炮制意义奠定基础。
1.1 仪器 Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪:G1312A二元泵、G1315B紫外检测器、G1316A柱温箱(美国安捷伦科技公司);KQ-250E型医用超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。
1.2 试药 甲醇、乙腈均为色谱纯,水为高纯水,其他试剂为分析纯。槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品(中国药品生物制品检定所,批号分别为:100081-200406、110861-200405、110860-200406,供含量测定用)。所购5批蒺藜饮片经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实,分别取100 g粉碎,过三号筛,备用。
2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(4.6 mm× 250 mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%甲酸溶液(47∶53);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;检测波长368 nm;进样量20μL。槲皮素、山柰素和异鼠李素分离度良好,无其他杂质干扰,见图1。
图1 HPLC色谱图
2.2 对照品溶液制备 分别精密称取槲皮素对照品7.25 mg,山柰素对照品3.65 mg,异鼠李素对照品3.10 mg,置同一50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备 取蒺藜样品1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇-25%盐酸(4∶1)的混合溶液25 mL,密塞,称定重量,沸水浴中加热回流1 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.4 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液0.1、0.4、1.6、3.2 mL,置5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。再分别精密量取以上稀释溶液和原混合对照品溶液各1.0 mL,用甲醇稀释定容至5 mL。各进样20μL测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果槲皮素在0.58~29.0μg·mL-1之间呈较好的线性关系(Y=219.55X+2.044,r=0.999 7),山柰素在0.292~14.6μg·mL-1之间呈较好的线性关系(Y=262.85X-1.638,r=0.999 8),异鼠李素在0.248~12.4μg·mL-1之间呈较好的线性关系(Y=614.17X+3.103,r=0.999 7)。
2.5 精密度试验 吸取“2.4”项下一稀释混合对照品溶液(槲皮素2.32μg·mL-1,山柰素1.168μg ·mL-1,异鼠李素0.992μg·mL-1),重复测定5次,结果槲皮素、山柰素和异鼠李素的精密度均较好(RSD分别为0.76%、0.73%和0.85%)。
2.6 稳定性实验 取同一蒺藜供试品溶液,分别于0,2,4,8,12 h测定,结果槲皮素、山柰素和异鼠李素在12 h内的稳定性较好(RSD分别为1.04%、0.92%和1.21%)。
2.7 重复性试验 取5号样品粉末1.0 g,精密称定,共5份,照“2.3”项下制备供试品溶液,按确定的含量测定方法测定槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量,结果重复性好,变异系数小,符合含量测定要求(RSD分别为1.29%、0.98%和1.35%)。
2.8 加样回收试验 取已测定含量的5号样品约0.5 g,精密称定,共5份,加入5 mL槲皮素、山柰素和异鼠李素混合对照品溶液(分别精密称取槲皮素对照品2.17 mg置10 mL量瓶,山柰素对照品1.80 mg置50 mL量瓶,异鼠李素对照品2.00 mg置50 mL量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取以上3种对照品溶液1.0 mL稀释定容至同一50 mL量瓶中,即得)。再精密加入甲醇-25%盐酸(4∶1)的混合溶液20 mL,按确定方法测定,结果见表1~3。
表1 槲皮素回收率试验结果
表2 山柰素回收率试验结果
表3 异鼠李素回收率试验结果
2.9 样品含量测定 分别取5批蒺藜样品1.0 g各3份,精密称定,按“2.3”项下供试品溶液制备方法及“2.1”项下色谱条件测定,并计算各样品中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量,结果见表4。
表4 蒺藜样品测定结果(n=3)
本研究所用5批蒺藜均为炒制品,是目前常用炮制品,亦是常见的市售品。样品测定结果与文献报道[2,3]均有不同程度下降,这是否与炒制相关,有待进一步确定。
安捷伦高效液相色谱仪二极管阵列检测器检测槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品发现3者最大吸收波长分别为:槲皮素(256 nm,368 nm),山柰素(265 nm,366 nm),异鼠李素(254 nm,370 nm),因此检测波长定为368 nm。
在供试品溶液制备方法的研究中,曾比较甲醇和无水乙醇提取的差异,两者未见显著差异,还对沸水浴回流时间进行了考察,发现1 h时黄酮苷元量已达平台。流动相选择仅对甲醇-0.1%甲酸溶液洗脱比例进行了调整以实现更好的分离效果。本研究所确定蒺藜饮片水解黄酮苷元HPLC测定方法,与传统总黄酮UV测定法[4]相比,简便易行,重现性、稳定性、准确度均较好,可用于蒺藜饮片的质量控制。
[1]李瑞海.中药蒺藜活性成分及质量评价研究[D].沈阳:辽宁中医药大学,2006:10-14.
[2]师勤,余伯阳.反相高效液相色谱法测定蒺藜类3种水解黄酮苷元的含量[J].药物分析杂志,1999,19(2):75-78.
[3]郝艳玲.HPLC法测定蒺藜中总黄酮的含量[J].实用药物与临床,2006,9(5):276-278.
[4]吴琼诗.蒺藜全草中总黄酮的含量测定[J].广东药学院学报,1998,14(4):273-275.
表3 3批样品含量测定结果(mg·g-1)
3.1 在提取条件比较时,采用本法直接加溶剂超声提取与《中国药典》2010年版(一部)[5]“三七”[含量测定]项先溶剂浸泡过夜再加热回流提取两法比较,两法提取效果没有显著差异,而本文采用的方法更简便、快捷。
3.2 本文建立的方法具有操作简便、灵敏度高、重复性好、测定准确等优点,能同时测定三七的3种主要活性成分,可以作为疏血通脉胶囊重要的质量控制指标之一。
参考文献:
[1]刘泰,韦必清,韦玉进.醒脑通脉胶囊对脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的影响[J].辽宁中医杂志,2005,32(2):89-91.
[2]刘泰,秦若飞,张青萍,等.醒脑通脉胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑后织IL-1β、IL-6和IL-8含量的影响[J].广西医科大学学报,2008,25(1):1-4.
[3]刘泰,谭璐璐,秦若飞,等.醒脑通脉胶囊对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠TNF-a的影响[J].广西中医学院学报,2008,10(4):13-16.
[4]姚曦,何伟,李勇,等.HPLC法测定复方贞术调脂胶囊中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Rb1的含量[J].中国药房,2011,22(15):1398-1400.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:11.
Determ ination of three flavonoid aglycones in Fructus tribuli by HPLC
ZHANG Chao
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China)
ObjectiveTo establish a HPLCmethod for the determination of the content of quercetin,kaempferol and isorhamnetin in Fructus tribuli.MethodsKromasil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)column was used to analyze three flavonoid aglycones contentwith methanol-0.1%methanoic acid aqueous solution(47∶53)as mobile phases.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at368 nm.ResultsThe linearity of each standard was established in the concentration range of0.58~29.0μg·mL-1for quercetin,0.292~14.6μg·mL-1for kaempferol,0.248~12.4 μg·mL-1for isorhamnetin,with correlation coefficient r>0.999 7.The average recoveries(n=5)of three flavonoid aglyconeswas 100.91%,99.46%,99.20%with the RSD of 1.91%,1.85%,1.73%,respectively.ConclusionThemethod was rapid,simple and accurate,which can be used in the quality control in Fructus tribuli.
Fructus tribuli;quercetin;kaempferol;isorhamnetin;HPLC
R927.2
:A
2095-5375(2014)03-0139-003
中医药行业科研专项项目-20种中药饮片炮制技术规范研究(No.201207004-9)
张超,男,博士研究生,副教授,研究方向:中药新药研究,E-mail:zhangchaotcm@126.com