辽宁绒山羊BMP-2基因表达的检测

薛 冰，郭 丹，王春艳，郑 旭，高 月，韩 迪⋆

（1.辽宁省畜牧科学研究院，辽宁 辽阳 111000；2.辽宁省辽宁绒山羊原种场有限公司，辽宁 盖州 115200）

辽宁绒山羊BMP-2基因表达的检测

薛 冰1，郭 丹1，王春艳1，郑 旭1，高 月2，韩 迪1⋆

（1.辽宁省畜牧科学研究院，辽宁 辽阳 111000；2.辽宁省辽宁绒山羊原种场有限公司，辽宁 盖州 115200）

本文研究了BMP-2基因在常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊皮肤组织中的表达情况，以β-actin基因作内标基因，分析了BMP-2 mRNA在季节与常年长绒型辽宁绒山羊皮肤中的表达量，结果发现在常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊皮肤组织中，BMP-2 mRNA的表达量常年长绒型略高于季节长绒型（P=0.079）。

骨形态发生蛋白；辽宁绒山羊；常年长绒

BMP家族目前已有17种BMP被分离和克隆，有8种BMP异形体已被识别，其中BMP-2和BMP-4是BMPs中生物学活性很高的分子。他们在机体中所起的生物学作用基本一致，并具有较高的氨基酸同源性，达到90%以上。Noramly[1]报道，从BMP-1至BMP-7的7个基因与羽毛胚芽的大小和空间分布相关，说明这个因子家族成员在毛囊发育中具有重要作用，其中BMP-2、BMP-4、BMP-7是生物活性最高的3种蛋白，在发育的毛囊中均有表达。BMP-2是BMPs中的一个成员，研究表明，BMPs在决定家畜不同时期的生长发育、骨骼形成以及繁殖性能有相当大的作用。BMP-2为分泌型蛋白，其生物活性较高，不仅具有促进软骨和骨组织形成的作用，而且对骨组织、脑组织和脊髓组织的生长、发育、分化有重要的调控作用，并参与细胞凋亡和细胞信号转导的调节[2]。同时BMP-2作为毛囊诱导的抑制物对于动物的毛囊形成和发育具有一定的调控作用，其在动物的毛囊部位有一定的表达量[3]。

从分子角度对辽宁绒山羊毛囊发育基因进行研究，对了解绒山羊的品种特性，指导其选育具有极其重要的指导意义。本研究在对常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊的BMP-2基因的外显子部分序列进行克隆、测序的基础上[4]，开展了RT-PCR法分析BMP-2基因在常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊皮肤组织中的表达情况检测的研究。

1 材料与方法

1.1 试验动物选取辽宁省辽宁绒山羊科技示范场常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊成年母羊各6只，年龄2～3岁，要求羊只健康、体型中等、膘情正常。于12月份采取耳组织样和所需皮肤样，皮肤样采样部位为肩胛骨后缘，用采样器采取1.0 cm2皮样。

1.2 试剂试验用生物药品及试剂M-MLV反转录酶、Taq酶、Rnase、DNA Marker均购自大连宝生物工程公司；RT-PCR反应试剂盒由华美公司生产；各种dNTP均由北京鼎国生物公司生产；Tris、KCl、MgCl2、氯仿、异丙醇、酚、NaCl、NaAC等均为国产分析纯；β-Actin购自北京鼎国生物公司。

1.3 引物设计与合成合成BMP-2引物[4]，合成β-Actin基因引物[5]，引物合成均由大连宝生物工程有限公司合成，引物合成后用无RNase的灭菌双蒸水稀释成20μM，-20℃保存备用。

1.4 提取采用Trizol试剂法，提取季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊皮肤组织中总RNA。

辽宁绒山羊基因组总RNA

1.5 含量的检测甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性，利用紫外分光光度计测定RNA的OD260/OD280值，计算RNA含量。

基因组总RNA

1.6 反应分别以提取的季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊皮肤组织RNA为模板，使用设计的BMP-2、β-Actin基因引物进行RT-PCR扩增。RT反应体系：M-MLV 5×Reaction Buf fer 5.0μL；dNTP Mixture（25 mmol）1.0μL；RNasin Ribonu-

RT-PCRclease Inhibitor（15 U/μL）1.0μl；M-MLV反转录酶（200 U/μL）1.0μL；ol igo（dT）1.0μL；总RNA 5.0μL；RNase-Free Water 11.0μL。扩增条件：42℃温育60 min，95℃水浴5 min，取2μL进行PCR扩增。PCR反应体系：RT反应液2.0μL；10× Ex Taq Buf fer 5.0μL；dNTP Mixture（2.5 mmol）4.0μL；上、下游引物各2.0μL；Ex Taq DNA polymerase0.5μL；ddH2O 34.5μL。混匀后按以下反应条件进行PCR扩增：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸5 min，反应结束。

1.7 PCR 产物的检测取上述PCR反应产物2μL，与10×电泳上样缓冲液混匀，以DL 1 000 DNA Marker作为参照，加样于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压5 V/cm，时间40 min，用凝胶成像系统观察并保存。

1.8 电泳产物的图像与数据分析利用西盟公司（SIM）图像分析软件BIO 1D系统进行结果分析，将BMP-2基因与β-Actin基因各自的DNA电泳条带面积比作为BMP-2 mRNA相对水平的参数，对BMP-2基因的PCR产物进行相对定量分析，数据结果以平均数+标准差表示。采用统计软件SPSS 11.5对图像分析数据进行方差分析。

2 结果

2.1 提取结果从季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊的皮肤组织中提取基因组总RNA，浓度大约为500 ng/mL，大小为50 kb以上。经分光光度计检测，所提取的RNA纯度的OD260/OD280约为1.7，用TE对DNA进行适度的稀释，使其终浓度约为100 ng/μL。基因组总RNA

2.2 扩增结果分别用季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊的皮肤组织中提取的基因组总RNA为模板进行RT-PCR扩增，在1.5%琼脂糖凝胶电泳中检查，结果扩增片段大小与预期大小相符，见图1。PCR

图1 辽宁绒山羊β-actin基因和BMP-2 m RNA基因的RT-PCR产物Fig.1 RT-PCR results of BMP-2 mRNA andβ-actin

2.3 基因的表达量利用SIM公司的BIO 1D图像分析软件系统分析目的基因与β-actin BMP-2 mRNA基因条带面积，以二者面积比值表示BMP-2 mRNA在季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊中的相对表达量，见图2。

图2 季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊BMP-2 m RNA表达比较

根据检测结果，季节与常年长绒型辽宁绒山羊中均有BMP-2 mRNA的表达，而且常年长绒型辽宁绒山羊的表达量略高于季节长绒型辽宁绒山羊的表达量，但差异不显著（P=0.079）。

3 讨论

β-actin是actin家族的一员，是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分，分布广泛。在维持细胞的结构、细胞内运动、细胞分裂等细胞生理活动方面起重要作用。研究表明，β-actin具有基因序列高度保守、mRNA表达数量高且稳定的特点，在脊椎动物中不同物种的β-actin基因之间的序列同源性超过98%，常作为内参基因被广泛使用[6-10]。Swiderski等[11]认为，用β-actin为内源性内标来校正RNA提取、上样量和反转录效率等误差，做非竞争性的相对定量RTPCR，以目的基因相对于持家基因的RT-PCR产物量作为该基因表达水平，方法简单、重复性好。

本试验以β-actin基因为内参，利用RT-PCR法分析了BMP-2基因在常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊皮肤组织中的表达情况。目的是发现并找出BMP-2基因在两种类型辽宁绒山羊皮肤组织的作用以及表达的差异。试验分析了BMP-2 mRNA在季节长绒型与常年长绒型辽宁绒山羊皮肤中的表达量，结果发现在常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊皮肤组织中，BMP-2 mRNA的表达量差异不显著，但常年长绒型略高于季节长绒型（P=0.079）。这与郭翠华等[12]研究中的季节长绒型辽宁绒山羊血清IGF-Ⅰ的浓度高于常年长绒型绒山羊结论相类似，说明常年长绒群体和季节长绒群体在分子水平上存在本质差异，为进一步定位常年长绒调控基因提供了理论依据。

有报道表明，在毛囊发育的起始阶段中，有许多毛囊诱导的刺激物和抑制物，它们之间存在着一种密切配合的平衡，而BMP家族成员在毛囊形态发生的过程中主要起抑制性作用。BMP-2/4是毛囊发育阶段的抑制物的信号途径之一，oggin作为BMP的抑制因子，在毛囊形态发生中对BMP的效应起调节作用[13]。

RT-PCR试验结果表明，BMP-2基因在常年长绒型和季节长绒型辽宁绒山羊皮肤中均有表达。本试验只对成年辽宁绒山羊的皮肤组织进行了检测，尚无法确定BMP-2基因mRNA表达水平在辽宁绒山羊不同发育时期的差别及其在皮肤中表达的确切位置等，均有待于进一步的试验来验证。

[1]Noramly S,Morgan B A.BMPs mediate lateral inhibition at successive stages in feather t ract development[J].Development,1998,125: 3775-3787.

[2]Boguski MS.Comparative Genomics:The mouse that roared[J].Nature,2002,420:515-516.

[3]赵珺.内蒙古绒山羊与蒙古绵羊BMP-2基因片段的克隆及表达[D].内蒙古农业大学，2006.

[4]薛冰，郭丹，王春艳，等.辽宁绒山羊BMP-2基因的克隆及序列比较分析[J].现代畜牧兽医，2011，12：45-48.

[5]姜怀志，戢爽，高爱萍，等.妊娠期绵羊子宫内膜Fl t-1基因表达的RT-PCR检测[J].家畜生态，2001，22（2）：30-34.

[6]Xiaozhu Zhang,Lily Ding,Andrew J Sandford. Selection of reference genes for gene expression studies in human neut rophi ls by realtime PCR[J].BMC Mol Biol,2005,6（1）:4.

[7]Neuvians TP,Gashaw I,Sauer CG,et al.Standardization st rategy for quantitative PCR inhuman seminoma and normal testis[J].J Biotechnol,2005,117（2）:163-171.

[8]李建林，俞菊华，唐永凯，等.黄鳝β肌动蛋白基因的克隆与序列分析[J].中国水产科学，2005，1（2）：187-191.

[9]Zhao XQ,Pang D,Xue YW.Expression of the cyclooxygenasw-2 gene in human breast carcinoma [J].Zhonghua Wai Ke Za Zhi,2003,41（6）:427-429.

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[11]Swiderski CE,Klei TR,Horhow DW,et al. Quantitative measurement of equine cytokine mRNA expression by Polymerase chain reaction using target-speci fic standard curves [J].Immunol Methords, 1999, 222（l-2）:155-169.

[12]郭翠华，贾存灵，张微，等.辽宁绒山羊IGF-Ⅰ基因5′调控区多态性与产绒性状相关[J].生物化学与生物物理进展，2009，36（5）：566-573.

[13]Botchkarev VA,Botchkareva NV,Nakamura M, et a1. Noggin is a mesenchymal ly derived stimulator of hair fol l icle 1nduction[J]. Nat Cel l Biol,1999,1（3）:158-164.

（编辑：郭雪峰）

The expression of the BMP-2 gene in the skin of Liaoning Cashmere goat

Xue Bing1，Guo Dan1，Wang Chunyan1，Zheng Xu1，Gao Yue2，Han Di1*
1.Institute of Animal Husbandry of Liaoning Province,Liaoning Liaoyang 111000；2.Corporation of Liaoning cashmere goat original farm of Liaoning Province,Liaoning Gaizhou 115200）

In order to detect the expression of the BMP-2 gene in the skin tissues of perennial and seasonal type of Liaoning Cashmere goat,β-actin gene was used as an internal standard gene. The resul ts showed that the expression level of BMP-2 mRNA in perennial type of Liaoning Cashmere goat was slight ly higher than that in seasonal type of Liaoning Cashmere goat skin tissues（P= 0.079）.

Bone Morphogenetic Protein;Liaoning Cashmere goat;Last-growth cashmere

S813.1

：B

：1672-9692(2014)02-0025-04

2014-01-20

薛冰（1979-），女，农业推广硕士，畜牧师，主要从事绒山羊选育种工作。

韩迪（1979-），男，硕士研究生，高级畜牧师，研究方向为绒山羊育种。

辽宁省公益基金项目（2012005005）