金黄色葡萄菌球菌毒力基因在传代过程中的稳定性

孙美英，何剑斌

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

金黄色葡萄菌球菌毒力基因在传代过程中的稳定性

孙美英，何剑斌⋆

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

为了解分离自奶牛乳房炎的金黄黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）毒力基因在传代过程中的稳定性，对传代前后金黄色葡萄球菌的毒力和毒力基因进行测定和检测。本研究采用急性毒性试验的方法测定8株金黄色葡萄球菌原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代的菌株对小鼠的半数致死量，通过聚合酶链式反应（PCR）检测原代、第5代、第10代、15代、第20代及第25代的菌株中5种毒力基因ZFB、ALF、BET、X jngm及Nuc的变化情况。试验结果表明，金黄色葡萄球菌在传代过程中毒力基因分布较稳定；但X jngm、ALF、BET基因极易发生变异。经小鼠腹腔连续多次传代后毒力逐渐增大，可推知X jngm毒力基因与毒力相关性最大，并易受传代影响。

金黄色葡萄球；毒力基因；传代；稳定性

金黄色葡萄球菌是广泛的感染人和不同种动物的一种常见致病菌，主要分离自奶牛乳腺炎[1]。金黄色葡萄球菌致病力与其能大量产生细胞外毒素和毒力基因密切相关。金黄色葡萄球菌所分泌的α溶血素、β溶血素、粘附素B[2]、耐热核酸酶、血浆凝固酶等是重要的毒力因子。ALF、BET、ZFB、Nuc及Xjngm是编码此类毒力因子的重要毒力基因，与金黄色葡萄球菌有无毒力或毒力强弱有较高相关性。一般情况下，病原菌在体外人工培养基上连续多次传代后，毒力一般都逐渐减弱甚至消失，而在大量的动物试验中，都是通过将细菌接种于动物腹腔的方法提高细菌毒力。本研究通过对传代前后金黄色葡萄球菌毒力基因的检测分析，探讨传代对毒力基因分布的影响，而上述这些方面的研究力图揭示病原菌在连续传代时的毒力变化是否与病原菌毒力基因型选择相关，可为充分掌握病原菌在传代时毒力发生变化的原因提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC2393购自杭州天和微生物试剂有限公司，试验金黄色葡萄球菌株皆分离自近期辽宁沈阳周边奶牛场患乳房炎的病牛。各金黄色葡萄球菌株用50%甘油-70℃保存。

1.1.2 试验动物 15～20 g的SPF级雌性和雄性昆明小鼠。小鼠体况相近时用于试验，试验期间小鼠于室温稳定的清洁级鼠房饲养。

1.2 方法

1.2.1 细菌毒力测定 试验时，各菌株均分别接种普通血琼脂平板（37℃培养24 h）复苏，然后接种3 mL的LB液体培养基，37℃ 300 r/min培养10 h后，2 000 r/min离心10 min，用灭菌生理盐水配制成OD为1的菌液。取10只小鼠腹腔注射金葡菌液1 mL，记录第1代小鼠存活时间；将第1代腹腔注射死亡最早的小鼠用酒精消毒后解剖，用无菌棉签取样，接种于血平板中37℃培养24 h，用灭菌的生理盐水配制OD为1的金葡菌，取10只小鼠腹腔注射菌液1 mL，记录第2代小鼠存活的时间。重复试验并记录直到第25代小鼠的存活时间。

1.2.2 细菌鉴定 对每代死亡小鼠腹部进行消毒，剖开腹腔用无菌棉签取样，革兰氏染色涂片鉴定，细菌血平板培养，对培养出来的菌落进行生化鉴定[4]和PCR鉴定[5]。

1.2.3 DNA的提取及纯化 取新培养好的菌体（10株金葡菌的原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代菌体）按SDS法提细菌基因组DNA。方法如下。

细菌接种于5 mL液体LB中，37℃摇床（300 r/min）培养过夜。取1 mL培养物于1.5 mL EP管中，室温8 000 r/min离心5 min，弃上清沉淀重悬于1 mL TE（pH 8.0）。菌体裂解：加入6μL 50 mg/mL溶菌酶37℃ 2 h，再加2 mol/L NaCl 50μL、10%SDS 110μL和20 mg/mL蛋白酶K 3μL，37℃过夜。抽提：取1 mL菌液加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混匀，室温放置10 min 12 000 r/min离心10 min。取800μL上清（注意不要吸到中间蛋白层）加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25: 24:1）混匀，室温放置10 min，12 000 r/min离心10 min。取500μL上清加0.6倍体积异丙醇（冷）混匀放-20℃ 20 min，12 000 r/min离心10 min弃上清洗涤，沉淀用75%乙醇洗涤7 500 r/min离心10 min弃乙醇抽晾干后溶于50μL TE中。

1.2.4 毒力基因检测

1.2.4.1 引物设计 根据Genbank中公开发表的金黄色葡萄球菌主要毒力因子溶血毒素、血浆凝固酶和黏附素耐热核酸酶序列设计检测特异引物，并由上海生工合成引物。引物序列见表1，用去离子水按20μmol/L的浓度溶解，-20℃保存备用[6]。

1.2.4.2 PCR反应扩增及序列测定 PCR扩增体系：25μL PCR反应体系：10×PCR buf fer 2.5μL，Mg2+（25 mM）1.5μL，dNTP（40 mM）0.5μL，Taq酶（2.5 U）0.5μL，引物各1μL，模板2μL，无菌双蒸水14μL。

表1 5种毒力基因PCR扩增引物序列Table1 PCR am plification primer sequences of Five virulence gene

PCR产物电泳检测：取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶浓度为2%，电泳电压90 V，电泳时间25 min，经凝胶成像后统计结果[7]。

1.2.5 传代过程中存的测定 取新鲜培养好的菌液（10株金葡菌的原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代菌体），分别注射入小鼠腹腔通过死亡时间判断毒力大小变化。

表2 5种毒力基因反应程序Table2 Response procedures of five virulence genes

2 结果

2.1 传代过程中5种毒力基因分布的变异结果

2.1.1 8株金葡菌在传代过程中5种对基因的PCR扩增结果 见图1。

图1 8株金葡菌在传代过程中5种毒力基因的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amp lification electrophoresis figure of 5 virulence genes 8 strains s.aureus bacteria in the process of batches

2.1.2 8株金葡菌在传代过程中5种对基因的遗传稳定性 从图1可以计算出5种毒力基因在传代过程中的携带率，可以看出5种毒力基因在原代、第5代、第10代、第15代、第20代及第25代分布结果显示其遗传稳定性较高，Xjngm、ALF、BET基因携带率发生较大变化，尤其Xjngm在第20代和第25代该毒力基因均未检出。Nuc在原代、第5代、第10代、第15代、第20代携带率基本没变化，在第25代携带率变化较大。ZFB的携带率基本没变化，见图2。

2.2 传代过程中小鼠平均存活时间的变化结果 见图3和表3。

从图3可以看出，经过多次传代后，随着代数的增加，菌株的毒力逐渐增强。根据表3可知，LSD0.05=4.872，LSD0.01=6.537可知，原代与第5代、第10代、第15代、第20代及第25代差异极显著。

表2 5种毒力基因反应程序Table2 Response procedures of five virulence genes

图2 8株金黄色葡萄球菌在传代过程中5种毒力基因的携带率Fig.2 Carrying rate of 5 kinds virulence gene from 8 strains staphylococcus aureus in batches

图3 各代小鼠存活代数Fig.3 Survival time of each generation m ice

3 讨论

大量试验表明，金黄色葡萄球菌在经小鼠腹腔传代过程中，基因组发生较高频率突变，导致菌株发生变异，随着代数的增多，变异机会增大，毒力大小也发生明显变化，可见传代是使其毒力发生变化的一个不可忽视的因素。Xjngm、ALF、BET基因携带率发生较大变化，尤其Xjngm在第20代和第25代该毒力基因均未检出。Nuc在原代、第5代、第10代、第15代、第20代携带率基本没变化，在第25代携带率变化较大。ZFB的携带率基本没变化。经测序与原代序列同源性达99%。

本试验所检测的5种毒力基因均是致病菌侵染途径中较重要的因子，经毒力与毒力基因型的比较分析，可推知，Xjngm、ALF、BET基因与毒力相关性较大，但是Xjngm、ALF、BET基因在传代培养过程中，极易发生变异。Xjngm、ALF、BET基因共同缺失导致毒力变化，还是其中一种单独缺失导致金黄色葡萄球菌毒力变化。ZFB是否与其他4种毒力基因相互协同作用导致毒力增强，由于是初步探索性试验还不能下结论，需要进一步试验证明。

致病菌所特有的毒力基因常位于转座子、质粒和噬菌体等可移动的遗传物质上。近年来，细菌毒力岛的发现使人们对细菌毒力的变异方面也有了新的认识，细菌的毒力基因在传代过程中发生的变异，应该与质粒、噬菌体及细菌毒力岛等遗传物质的变化相关[8-9]。

毒力因子往往是疫苗的主要组成成分，因此对毒力因子进行深入研究的目的除了了解其致病机理外，对疫苗的研究也有重要意义。维持毒种在规定传代次数内的遗传稳定性，是所生产的疫苗安全性、有效性和高产性的重要保证。

[1]Watts J.L.Etiological agents of bovine mastitis[J]. Vet.Microbiol,1988,16(1):41-66.

[2]陈怀青.金黄色葡萄球菌的粘附素[J].中国人兽共患病杂志，1996，12（6）：43-44.

[3]王冬梅，刘磊，王胜利.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展，2005，26（6）：81-83.

[4]孔雪旺，陈功义.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国奶牛，2007，1（1）：43-44.

[5]El-Sayed A,Alber J,L mLer C,et al.PCR-based detection of genes encoding virulence determinants in Staphylococcus aureus f rom birds[J]. Vet Med Infect Dis Vet Publ ic Heal th,2005,5（2）:38-44.

[6]Dewanand,Yuvaraj Shanmugam,Nitin Vasant rao Kurkure. PCR-based detection of genes encodingvirulence determinants in Staphylococcus aureus from bovine subcl inical mastitis cases[J].Journal ofvet reinary science, 2007,8（2）:151-154.

[7]谢志勤，谢芝勋，唐小飞，等.多重PCR检测奶牛乳房炎3种主要病原体[J].畜牧与兽医，2006，38（7）：3-5.

[8]张兆山，杨正时，刘纯杰，等．病原细菌生物学研究与应用［M］.北京：化学工业出版社，2008：18-22．

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（编辑：张婷婷）

Stability of Virulence Genes in Staphylococcus aureus Strains During Subculture

Sun MeiYing,He JianBin*
（Shenyang Agricul tur University,animal husbandry and veterinary col lege,Liaoning Shenyang 110866）

To study the stabil ity of virulence genes of S.aureus st rains which was isolated f rom mastitis during subcul ture,toxicity and toxicity gene were detected before and af ter subcultured.8 st rains original,the 5th generation,the 10th generation,the 15th generation,the 20th generation and the 25th generation S.aureus were administered to mice in order to detecte the median lethal rate.Variation of Vir genes including ZFB,ALF,BET,Xjngm and Nuc were investigated by PCR.The resul ts showed that the vir gene dist ribution kept stable during passage.But Xjngm、ALF、BET genes mutated ext remely.Toxicity increased af ter passed many times f rom mice,which indicated that Xjngm has the most dependabi l ity to toxicity,and is easily be af fected by subcul ture.

S.Aureus;Virulence genes;Subcul ture;Stabil ity

S852.6

：B

：1672-9692(2014)02-0013-04

2013-12-02

孙美英（1988-），女，硕士研究生在读，研究方向为临床兽医。

何剑斌（1969-），男，教授，沈阳农业大学畜牧兽医学院院长，主要研究方向为临床兽医学。