白细胞介素17促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化

王彬 史嘉伟 董念国

.基础研究.

白细胞介素17促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化

王彬 史嘉伟 董念国

目的 研究白细胞介素17（IL-17)是否促进主动脉瓣膜钙化形成及其可能机制。方法利用体外主动脉瓣膜间质细胞培养技术，瓣膜间质细胞培养传代3～5次后，采用简单随机抽样法分为两组:（1)对照组，细胞培养基中添加2 m l RPMI-1640完全培养液；（2)实验组，细胞培养基中添加2 m l RPMI-1640完全培养液和IL-17（50 ng/m l)。继续孵育48 h后，用细胞茜素红钙染色检测两组瓣膜间质细胞钙化情况，用Western blot和RT-PCR检测两组瓣膜间质细胞碱性磷酸酶（ALP)及骨形态蛋白2（BMP-2)的表达情况。结果 实验组细胞中明显钙结节形成，对照组细胞中少量钙结节形成；与对照组比较，实验组细胞ALP和BMP-2蛋白（0.741±0.063比0.184±0.032；0.900±0.060比0.396±0.030，均为P＜0.01)与基因（0.236±0.004比0.106±0.003；0.523±0.052比0.194±0.047，均为P＜0.01)表达量均明显升高。结论IL-17可促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化。

白细胞介素17； 主动脉瓣膜间质细胞； 碱性磷酸酶； 骨形态蛋白2

白细胞介素17（interleukin-17，IL-17)是由辅助性T细胞17（Th17)分泌的炎性细胞因子，参与了多种组织免疫性疾病（如银屑病、类风湿性关节炎和慢性肠道炎性疾病等)的发生和慢性炎症的形成［1］。IL-17与其受体结合后，不但可刺激相应组织细胞分泌化学趋化因子和黏附分子，促进炎性细胞浸润到组织损伤部位，加剧局部组织炎症反应［2］，还可促进相关细胞表达、核因子-κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)增加，同时促进RANKL与其受体核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factorκB，RANK)结合［3］。有研究报道，在动脉粥样硬化病变过程中，RANKL/RANK通路活性增加可促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化，加速血管钙化进程［4-5］。退行性主动脉瓣膜钙化的形成是类似于动脉粥样硬化病理改变的过程，瓣膜间质细胞在慢性炎症持续刺激下可发生活化、增生，并向成骨样细胞表型转化，最终导致瓣膜组织内钙化形成。因此，本研究拟探讨IL-17是否对主动脉瓣膜钙化形成具有促进作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

经医院伦理委员会批准，主动脉瓣膜间质细胞取自扩张型心肌病需心脏移植的受体患者。RPMI-1640完全培养液、GENMED细胞茜素红钙染色试剂盒、碱性磷酸酶（alkali phosphatase，ALP)和骨形态蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2)抗体及IL-17购自GIBCO公司；Trizol和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)引物购自Invitrogen公司，逆转录（reverse transcription，RT)试剂盒和PCR反应体系购自Fermentas公司。

1.2 瓣膜间质细胞的获取及培养

手术获得的主动脉瓣膜组织置于50 ml冷PBS离心管内，震荡数秒，除去残余组织及血凝块。然后置于2 mg/ml胶原酶溶液内，37℃孵育10 min，将瓣叶取出置于培养皿内，表面用无菌棉签轻擦数次。已除去内皮层的瓣叶组织在5 ml胶原酶中，37℃培养箱内孵育过夜。弃上清，加入5 ml培养液（含10%FBS，链霉素100 U/ml，青霉素100 U/ml及高糖的DMEM)混匀后，种植于50 ml培养瓶内，瓣膜间质细胞生长铺满80%瓶底时传代。

1.3 实验分组

瓣膜间质细胞培养传代3～5次，转至六孔板培养。待细胞完全贴壁后，采用简单随机抽样法分为两组，每组设10个复孔:（1)对照组，细胞培养基中添加2 ml RPMI-1640完全培养液；（2)实验组，细胞培养基中添加2 ml RPMI-1640完全培养液和IL-17（50 ng/m l)。继续孵育48 h后，收集细胞，进行相关检测。

1.4 细胞茜素红钙染色

根据细胞茜素红钙染色试剂盒说明书小心、仔细操作，在一般光学显微镜下观察细胞钙化程度:钙沉积阳性细胞呈现桔红色。

1.5 Western blot法检测ALP和BMP-2蛋白表达

收集细胞先用RIPA裂解液匀浆处理，后测定细胞内总蛋白浓度，每个标本取50 μg蛋白进行电泳。顺序进行转膜-封闭-处理相应抗体-显色曝光。转膜条件:ALP和BMP-2（200 mA，95 min)；一抗稀释比:ALP（1∶800)，BMP-2（1∶200)。

1.6 RT-PCR法检测ALP和BMP-2基因表达

根据Trizol试剂盒说明书提取细胞内总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。取5 μg总RNA逆转录为cDNA，PCR法进行目的基因扩增（表1)，反应条件:50℃2 min；95℃10 min 1个循环，95℃30 s；60℃30 s 30个循环。各反应体系均以βactin作为内参引物，最终产物5 μl行琼脂糖凝胶电泳，软件分析凝胶图像目的基因灰度值。

表1 引物扩增片段和退火温度

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 细胞茜素红钙染色

实验组瓣膜间质细胞中可见钙结节形成明显增多（图1A)，对照组瓣膜间质细胞中可见少量钙结节形成（图1B)。

2.2 Western blot法检测结果

实验组和对照组均表达ALP和BMP-2，Bandscan图像处理软件计算实验组与对照组目的蛋白与内参条带灰度比值，提示实验组内ALP和BMP-2蛋白表达量均明显高于对照组（均为P＜0.01)，见表2、图2。

图1 细胞茜素红钙染色图（×200)

表2 实验组与对照组内目的蛋白与内参灰度比值（±s)

表2 实验组与对照组内目的蛋白与内参灰度比值（±s)

注:与对照组比较，aP＜0.01

组别样本数ALP/β-actin BMP-2/β-actin实验组10 0.741±0.063a0.900±0.060a对照组10 0.184±0.032 0.396±0.030

图2 两组瓣膜间质细胞ALP和BMP-2的蛋白表达: Western blot检测可见实验组灰度比值明显高于对照组

2.3 RT-PCR法检测结果

实验组和对照组均见ALP和BMP-2基因条带，Bandscan图像处理软件计算实验组与对照组目的基因与内参条带灰度比值，提示实验组内ALP和BMP-2基因表达量均明显高于对照组（均为P＜0.01)，见表3、图3。

表3 实验组与对照组内目的基因与内参灰度比值（±s)

表3 实验组与对照组内目的基因与内参灰度比值（±s)

注:与对照组比较，aP＜0.01

组别样本数ALP/β-actin BMP-2/β-actin实验组10 0.236±0.004a0.523±0.052a对照组10 0.106±0.003 0.194±0.047

图3 两组瓣膜间质细胞ALP和BMP-2的mRNA表达:RTPCR检测可见实验组灰度比值明显高于对照组

3 讨论

主动脉瓣膜钙化是老年人群中最常见的心脏瓣膜疾病，关于其发病机制目前了解较少，主动脉瓣膜置换术仍是严重瓣膜钙化唯一有效的治疗手段［6］。退行性主动脉瓣膜钙化的发生发展是多因素引起的，最初认为是由于随着年龄的增加，瓣膜老化、磨损导致钙磷无机物被动组织沉积引起的。随着对瓣膜钙化发生发展大量临床及基础研究不断深入，目前认为，退行性主动脉瓣膜钙化的形成是细胞及细胞分子相互作用，瓣膜间质细胞活化增生，并向成骨样细胞表型转化，主动发生的瓣膜组织钙化过程［7］。主动脉瓣膜钙化的病理性改变类似于动脉粥样硬化，其病理组织检测都表现有脂质沉积，炎症细胞浸润，新生血管形成，细胞活化增生并向成骨样细胞转化，表达合成骨基质蛋白，细胞外基质成分及结构发生重构样改变。它们还具有共同的高危因素，如高龄、男性、吸烟、高血压、血脂异常及高胆固醇血症、糖尿病等［8］。

Th17细胞主要通过分泌IL-17发挥其生物活性作用，IL-17受体广泛分布于组织细胞内，IL-17与其受体结合后，不但可诱导相关细胞进一步分泌各种化学趋化因子和黏附分子，如趋化因子CCL20、CCL5、CXCL18和细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1等，从而促进炎性细胞浸润到组织损伤部位，加剧局部组织炎症反应［9］。IL-17与其受体结合后，还可以促进相关细胞表达、合成RANKL增加，同时促进RANKL与其受体RANK结合。已有研究报道，在动脉粥样硬化病变过程中，RANKL/RANK通路活性增加可促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化，加速血管钙化进程。

IL-17作用于瓣膜间质细胞后能否促进间质细胞向成骨样细胞转化，至今国内外未见报道。我们通过体外主动脉瓣膜间质细胞培养技术，把主动脉瓣膜间质细胞培养传代3～5次后，用IL-17对主动脉瓣膜间质细胞进行干预。实验结果表明，实验组瓣膜间质细胞中钙结节形成数量明显多于对照组，瓣膜间质细胞表达成骨细胞特异性骨基质蛋白BMP-2和ALP程度也明显高于对照组（P＜0.01)，由此表明，IL-17具有促进瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化的生物活性。研究还发现，未施加干预的对照组瓣膜间质细胞也少量表达成骨细胞特异性骨基质蛋白BMP-2和碱性磷酸酶，发生这种现象的可能原因是:由于心脏瓣膜发育形成的细胞与分子调控机制类似于骨、软骨、肌腱的形成机制［10］，如转录因子碱性螺旋-环-螺旋转录因子（Twist-1)，肌节同源异形盒-2（Msx-2)，SRY-盒-9（Sox-9)等，都是非常重要的胚胎期瓣膜组织发育形成的调控因子，同时也调控着骨和软骨发育过程中间质祖细胞的形成［11］。因此，瓣膜间质细胞在培养过程中，受到外界刺激因素作用后，调控瓣膜发育的基因程序可能被再次激活、表达，导致少数瓣膜间质细胞发生了成骨样细胞转化，出现相应的钙结节形成及成骨细胞特异性蛋白BMP-2和碱性磷酸酶表达。

IL-17是强烈的促炎症反应因子，参与了多种组织免疫性疾病和慢性炎症的形成。我们的研究首次证实了IL-17可以促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞表型转化，其机制可能是通过RANKL/RANK信号通路实现的。RANKL是肿瘤坏死因子超家族成员之一，可由成骨细胞和T淋巴细胞分泌产生。RANKL还是生理性骨生成和淋巴细胞分化重要的调控因子，具有促进细胞增生，基质金属蛋白酶1的表达、活化，基质金属蛋白酶2的激活作用，并可促进间质细胞向成骨样细胞转化［12］。体外主动脉瓣膜间质细胞培养，用RANKL刺激可促进瓣膜间质细胞钙化结节形成，诱发骨生成相关基因表达，细胞向成骨样细胞表型转化［13］。IL-17可促进RANKL表达、合成增加，并促进RANKL/RANK信号通路活化。

RANKL/RANK信号通路活化后，导致核因子-κB发生核内转移，从而激活一系列相应目的基因转录、表达。有研究表明，RANKL与溶骨细胞表面RANK结合，诱发一系列反应导致骨组织吸收，细胞外基质降解，但必须在成骨细胞存在的前提下，RANKL才具有骨组织破坏作用［14］。由此也表明，RANKL参与瓣膜钙化形成的机制是多方面的，因为钙化瓣膜组织中不但有成骨样细胞存在，还发现有溶骨细胞。

总之，主动脉瓣膜钙化形成过程中，瓣膜组织内浸润的Th17细胞通过分泌IL-17，一方面加剧组织内炎症反应的程度，同时还可通过RANKL/RANK信号通路促进瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化。明确了Th17细胞及其分泌的炎性细胞因子IL-17在瓣膜钙化形成中的作用，为今后探索防治主动脉瓣膜钙化方法提供新的理论依据。

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IL-17 stimulates aortic valve interstitial cells transform ation into osteoblast-like cells

Wang Bin，Shi Jiawei，Dong Nianguo.
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To investigate whether IL-17 could stimulate aortic valve interstitial cells transformation into osteoblast-like cells.M ethods Human aortic valve interstitial cells were cultured via culture technology in vitro，and random ly divided into two groups after the subcultivation for three to five generations:the control group，adding 2 ml RPMI-1640；the experiment group，adding 2 ml RPMI-1640 and IL-17（50 ng/m l).After 48 hours，the calcification of valve interstitial cells was detected by cell alizarin red staining and the expression of alkali phosphatase（ALP)and bone morphogenetic protein-2（BMP-2) was examined by RT-PCR and Western Blot analysis.Results Compared with the control group，valve interstitial cells in the experiment group had more calcium nodus and expressed more protein and mRNA of ALP（0.741±0.063 vs.0.184±0.032；0.900±0.060 vs.0.396±0.030，both P＜0.01)and BMP-2（0.236±0.004 vs.0.106±0.003；0.523±0.052 vs.0.194±0.047，both P＜0.01).Conclusions IL-17 can stimulate aortic valve interstitial cells transformation into osteoblast-like cell.

Interleukin-17； Aortic valve interstitial cell； Alkali phosphatase； Bone morphogenetic protein-2

Dong Nianguo，Email:Dongnianguo@hotmail.com

2014-06-09)

（本文编辑:谭潇)

This work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China（No.87210297)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.05.011

国家自然科学基金项目（87210297)

430022武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科

董念国，电子信箱:Dongnianguo@hotmail.com