基于中西医结合方法的大鼠过敏性紫癜模型的建立*

张晓强 王 娟 刘品莉 程玉钏

周晓莉 赵剑锋 赵惠萍 张剑 陈 鑫山西省中医医院风湿免疫科(太原030012)

目前鲜有关于过敏性紫癜(AP或HSP)动物模型的文献报道，有关本病病因、病机的探索、治疗方法的评价和新药的研发在很大程度上受到限制。本实验创造性地采用中西医结合思路造模。制作出较为相似、可靠的HSP大鼠模型，且其临床指标、病理改变均接近人类HSP。现报道如下。

1 实验方法 1．1 材料与方法 1．1．1动物与分组:健康纯种SD大鼠40只，清洁级，体重(180±20g)，6周龄，♀♂各半，由山西省中医药研究院动物室供应(使用许可证:SYXK(晋)2010-0002，质量合格证:0000036)，实验期间大鼠饲养于山西省中医药研究院中心实验室动物房。适应喂养1周后对40只SD大鼠按随机数字表法分为模型组和对照组(各20只)，依据分组不同分笼饲养于代谢笼中，自由摄取标准饲料及水。之后对模型组大鼠进行造模。期间对照组采用等量生理盐水灌胃及注射。

1．1．2 主要试剂和仪器:主要试剂和药物:胡椒、干姜、荜茇中药配方颗粒剂(批号分别为:1008098，1011058，1007020，江阴天江药业有限公司);脂多糖(LPS)10mg装(批号326A055，Sigma L2880，北京索莱宝科技有限公司);鸡卵蛋白(OVA)普通级，10g装(批号 20110112，Sigma A5253，北京索莱宝科技有限公司分装);氢氧化铝凝胶4%g/mL，100mL装(批号201102103，天津药业集团新郑股份有限公司);伊文思蓝(批号7116588，国药集团化学试剂有限公司);0．9%氯化钠注射液2．25g，250mL(批号 N12040304-1，四川科伦药业股份有限公司)。

1．1．3 方法:1．1．3．1血热证动物模型的建立:干姜、荜茇、胡椒以1:1:1比例在60℃恒温水浴锅上浓缩成12．5g%mL水溶液，置4℃冰箱储存备用。将动物适应实验环境1周后予模型组大鼠灌胃，0．14 g/只，均2次/d，对照组给予等量生理盐水灌胃，自由饮食。用药3周。

1．1．3 ．2 过敏反应试验:之后将模型组大鼠给予腹腔注射含OVA1mg+氢氧化铝凝胶0．5mL+800ng LPS+1%伊文思蓝的生理盐水1mL/只，1次/7d，共2次。第二次注射后10min内皮肤外涂含OVA1mg+氢氧化铝凝胶0．5mL+800ng LPS的生理盐水1mL/只进行激发过敏反应。对照组用等量生理盐水操作。激发过敏30min后处死动物，剪取背部皮肤，观察皮内层的出血点。

1．2．2 模型观察与指标检测:1．2．2．1 一般状况观察:包括不同组别、不同时段鼠体温、精神状况、进食进水量、毛被、活动量、舌苔、口唇、结膜、耳廓、粪便颜色和硬软度、尿液量、颜色、气味等。

1．2．2 ．2 实验室指标测定:在实验前、实验结束时，两组大鼠随机处死10只。处死大鼠前24h留取尿液，用全自动尿液分析仪测定尿常规和尿沉渣定量。之后对上述大鼠取血约10mL，1h内用全自动血流变分析仪观测血液流变性(包括全血粘度、血沉等);用全自动血细胞分析仪观测血常规(血小板计数、白细胞计数等)。

1．2．2 ．3 皮肤和肾脏一般观察及病理检查:观察两组不同时段实验大鼠皮内层有无瘀点、瘀斑出现。在实验前、实验结束时，两组大鼠各取4只，观察肾脏外形，并切取部分肾组织置于40g/L中性甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，分别行HE染色，在光镜下观察肾组织病理改变。

1．2．3 统计学处理:资料数据以均数±标准差示，由SPSS 16．0软件统计处理，采用One-Way ANOVA单因素方差分析，LSD和S-N-K法作组间比较。

2 结果与分析 2．1 一般情况 对照组大鼠精神、摄食均较正常;模型组大鼠在进行了3周中药灌胃后出现不同程度的口渴喜饮、进食量稍大、精神萎靡不振或烦躁、呼吸频率增高、口唇发干、耳廓赤红、眼结膜充血、粪便干燥、小便发黄、偶见鼻衄。在第1次腹腔注射含OVA1mg+氢氧化铝凝胶0．5mL+800ng LPS+1%伊文思蓝的生理盐水后出现精神萎靡、食欲不振、鼠毛蓬乱，在第2次注射后情况加重，并有2例大鼠死亡(死因可能系超敏反应)，之后各组大鼠均未出现死亡。在进行皮毛外涂擦上述药物后，有部分皮肤紫癜出现(见图1-1，1-2)，此情况约1周可自行缓解。

2．2 尿液检查 2．2．1血尿:对照组大鼠在实验过程均未出现肉眼血尿和镜下血尿。造模前模型组大鼠尿红细胞计数阴性，在造模后大鼠均出现红细胞超量。试验后模型组大鼠尿红细胞计数较实验前及对照组试验后显著增多 (均P＜0．01)。见表1。

表1 对照组与模型组尿红细胞计数比较(个/μl)( ±s)

表1 对照组与模型组尿红细胞计数比较(个/μl)( ±s)

注:与对照组相比△P＜0．05▲P＜0．01;与实验前相比◇P ＜0．05 ◆P ＜0．01。下同。

组别 动物数 实验前 试验后对照组10 5．00 ±1．31 4．88 ±1．36模型组 10 5．27 ±0．41 18．52 ±1．28▲◆

2．2．2 尿蛋白:造模前模型组大鼠尿蛋白定性阴性，在造模后模型组出现尿蛋白。试验后模型组大鼠尿蛋白定量较实验前及对照组试验后显著增多(均P＜0．01)。见表2。

2．3 血液检查 2．3．1血液流变性:造模后动物的全血粘度较造模前及对照组试验后在低切、中切、高切下明显增高(P＜0．01或P＜0．05);造模后动物的血沉较造模前及对照组试验后明显增高(均P＜0．01)。表明血液粘度增高，流动性变差;红细胞聚集性增加。见表3及表4。

2．3．2 血常规:造模后动物的PLT、WBC值较造模前及对照组试验后明显增高(P＜0．01)，表明免疫炎症状态较重。见表5。

表2 对照组与模型组尿蛋白定量变化(mg/24h)( ± s)

表2 对照组与模型组尿蛋白定量变化(mg/24h)( ± s)

组别 n 实验前 试验后对照组10 49．72 ±3．57 51．11 ±4．33模型组 10 47．48 ±3．42 152．52 ±21．39▲◆

表3 模型组与对照组大鼠全血粘度(mPa/s)比较±s

表3 模型组与对照组大鼠全血粘度(mPa/s)比较±s

组 别 n 低切实验前 试验后中切实验前 试验后高切实验前 试验后对照组 10 13．30 ±2．88 13．17 ±3．40 5．16 ±0．81 4．97 ±0．92 4．42 ±1．03 4．73 ±1．09模型组 10 12．97 ±2．48 14．26 ±4．10▲◆ 5．47 ±0．73 7．29 ±0．56▲◆ 4．52 ±0．94 6．15 ±0．90▲◆

表4 模型组与对照组大鼠血沉比较±s(mm/h)

表4 模型组与对照组大鼠血沉比较±s(mm/h)

组别 n 实验前 试验后对照组10 8．78 ±3．37 9．06 ±5．09模型组 10 9．12 ±3．56 79．72 ±13．57▲◆

2．4 肾组织病理学改变 对照组大鼠实验前后肾表面光滑，颜色浅褐，皮、髓质分界清晰。模型组部分大鼠肾肿大，颜色暗红，个别表面可发现皱起，皮、髓分界可见模糊。光镜观察显示模型组大鼠肾脏表现出部分肾小球分叶不明显，系膜区略增宽，轻中度的系膜细胞和基质增生，基底膜增厚，胶原纤维沉积增多(黑褐色)，提示HSP模型亦有同人类患者相似的肾脏受损(见图 1、图2、图3、图4)。

表5 模型组与对照组大鼠血常规指标比较(×109)(±s)

表5 模型组与对照组大鼠血常规指标比较(×109)(±s)

组 别 nPLT实验前 试验后WBC实验前 试验后对照组 10 735．96 ±127．55 729．15 ±127．13 8．49 ±2．56 8．70 ±2．83模型组 10 689．34 ±135．27 1116．79 ±224．89▲◆ 8．66 ±1．91 14．91 ±3．77▲◆

3 讨 论 过敏性紫癜(Ailegric Puprura，AP)，又称亨诺-许兰紫癜(Henoch-schonlein purpura，HSP)，是一种常见的血管变态反应性出血性疾病［1］。本病并发症多，复发率高，病程迁延，患病率逐年升高［2-3］。有关HSP的研究已成为近年来过敏性疾病研究的热点之一。目前本病病因尚不完全明了，一般认为与过敏有关，但在临床上致敏原常不易确定。众多研究发现该病病理主要是免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)介导的变态反应性疾病［4］，多克隆B淋巴细胞(B Lymphocyte，BC)活化及 Ig的分泌增加［5］。血管壁免疫复合物(Immunocomplex，IC)沉着，通透性增高，血液及淋巴液渗到组织间隙，引起皮肤黏膜、内脏器官渗出性出血和水肿。本病发病同时有细胞因子和炎症介质的参与，凝血机制也参与发病，遗传免疫因素的作用不可忽视。Moja等［6］在检测HSP患者血清后认定IgAI、分泌型IgA及抗麦胶蛋白IgA是HSP致病的重要抗体。另有多篇报道认为HSPN和IgA肾病(IgAnephropathy，IgAN)在肾脏病理改变上极为相似，难以区分，都是由IgA免疫异常所致。另有国内学者对HSP患儿进行血液流变学研究发现，无论是全血表观黏度、血液黏度、还是血浆黏度均增高，并有血沉增高，红细胞压积增大，提示存在高粘滞血症［7］，可加重免疫介导炎症反应。

上述研究成果与中医学对HSP病因病机的理解不谋而合，中医认为HSP患者多为先天禀赋偏颇，复感外邪而发病:患者先天阴虚质燥，营血之中已有伏火，复受风热、温热或药毒之邪，从而两热相搏，深入血分酿成本病。张蕊鹂［8］在硕士论文中通过对普通儿童和HSP儿童体质分布的研究，结果显示小儿的体质特点是决定HSP发生的内因。HSP儿童中医体质不均衡质构成比以偏阴虚质(64．38%)最多，偏阴虚质与HSP的发病有紧密联系。而中医血热证动物模型具有较强的高粘滞血症、免疫活化及一般表现如皮肤紫斑、发热、烦躁、耳红、眼赤、溲赤、便干等［9-11］。

本实验创造性地模拟HSP的病因病机进行其模型的制备，即根据HSP的公认的现代医学研究成果，从病因、病理等诸方面和中医学HSP病人体质特点，采用中西医结合思路造模(即使实验动物达到“病证结合，病症统一”的目的)。首先参照文献建立血热证动物模型造就实验动物阴虚火旺的偏颇体质，后应用麦胶蛋白作为饮食抗原，持续性抗原刺激粘膜免疫系统，致BC多克隆活化，并应用经典的皮肤过敏手段建立HSP大鼠动物模型。本大鼠模型与对照组大鼠各组指标差异均具有统计学意义。造模组的全血粘稠度、白细胞、血小板、尿液分析及沉渣定量等指标与对照组相比有明显差异(P＜0．01或P＜0．05)。本实验所建立的HSP大鼠动物模型接近于HSP现代医学研究成果，并与中西医学认识的HSP患者体质特点合拍，基本达到“病证结合，病症统一”。

2011年笔者发表《过敏性紫癜动物模型的研制思路》后，国内数家研究单位及学者通过笔者的实验思路［12］与本实验基本同步进行了研究。如张奕星［13］等，综合模拟瘀热证与IgA肾病实验动物模型，复合建造HSPN模型，模型组大鼠虽然未出现明显皮下紫癜，但存在血尿及蛋白尿，肾脏病理及免疫组化结果支持造模成功;李彦红［14］等通过对日本大耳白兔热性药物的喂饮、腹腔注射卵白蛋白和弗氏完全佐剂生理盐水的混合液，耳缘静脉和背部皮内注射卵白蛋白生理盐水，激发过敏反应来构建HSP模型，结果显示大耳白兔症状、病理改变和实验室检查结果与人类HSP病变基本相似，有望构建良好的(HSP)兔模型。

另外韩冰虹［15］在2004年度黑龙江中医药大学博士学位论文的实验里采用口服麦胶蛋白的饮食抗原法建立的HSP动物模型，选用20只昆明种雌性小鼠模型实验，仅有3例小鼠出现了皮下紫癜表现，其皮肤和肾脏组织形态学变化，与患者皮肤、肾脏病理改变基本一致。张雅绚［16］在2010年度辽宁中医药大学硕士学位论文的实验里采用卵白蛋白为抗原免疫家兔，之后在家兔背部皮内注射卵白蛋白局部激发arthus反应(局限性免疫复合物沉积引起的变态反应)，只是在针刺部位出现皮肤红、肿、热之表现。上述模型的制作为高相似度HSP动物模型建立打下了一定的基础，其功劳值得肯定。

3 展望及不足 本课题所设计的动物模型思路也将广泛应用于其它HSP研究。从而使中西医学对HSP以及其他类似疾病的科研及诊治跨上一个新台阶。

由于实验条件的限制、时间紧张及笔者的能力所限，本实验尚有指标检测方面的遗憾，如本实验未能测定大鼠血清白蛋白、球蛋白、补体等免疫指标;本实验并没有使大多数模型大鼠出现皮肤紫癜表现。期待在以后的实验中可以得到完善和改进。

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［15］ 韩冰虹．过敏性紫癜实验动物模型和临床症状分级量化标准的探讨［D］．2004年度黑龙江中医药大学博士学位论文:32-35．

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