两株野鸭源新城疫病毒分离株F基因和HN基因的分子特性分析

徐 钰，解林红，耿海东，高晓龙，王海军，范胜涛，李元果，王铁成，吴长江，张晓田，孙贺廷，初 冬，高玉伟＊

（1.国家林业局野生动物疫源疫病监测总站，辽宁沈阳110034；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；4.国家林业局长春野生动物疫病研究中心，吉林长春130122）

新城疫（Newcastle disease，ND）又名亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种多病型的高度接触性急性传染病。本病传播快，具有很高的发病率和病死率，被列为我国进境动物的一类传染病。ND作为世界动物卫生组织（OIE）规定的必须报告的疫病与其他副黏病毒成员相比，其流行与传播更具广泛性，可引起世界性的大流行，对野生鸟类资源安全和家禽养殖业影响重大［1］。根据已有的文献报道，除家禽外，已证实有27目至少236种野生鸟类可以自然或者实验性感染NDV，其中抵抗力最强的是水鸟，最敏感的是群居鸟，环颈雉、鹌鹑、燕八哥、鹦鹉等无论是野生还是人工饲养的都可感染［2］。

NDV属副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，是一种具有囊膜的单股、负链、不分阶段的RNA病毒，其基因组包含6个基因，按照3′-NP-P-M-F-HN-L-5′排列，分别编码6个主要结构蛋白［3］。根据NDV基因组长度、F基因和L基因序列，NDV可分为ClassⅠ类（1～9亚型）和ClassⅡ类（1～9亚型）两大分支，ClassⅠ类NDV绝大部分为弱毒株，其自然宿主是野生水鸟及活禽市场中的鸡。刘华雷等［4］2008年首次报道我国存在ClassⅠ类基因3型NDV弱毒株，随后，研究人员通过对我国ClassⅠ类NDV的分子流行病学调查分析表明，目前我国存在的ClassⅠ类NDV以2型和3型为主。

F蛋白具有使病毒脂蛋白囊膜与宿主细胞膜融合的功能，参与病毒的穿入过程。同时F蛋白是主要的宿主保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，F蛋白裂解位点的差异与病毒独立直接相关，根据F基因序列分析，所有强毒株裂解位点氨基酸残基为112R-R-Q-R/K-R-F117，弱毒株裂解位点为112E/GR/Q-Q-E/G/D-R-L117［5-6］。血凝素-神经氨酸酶糖蛋白（HN蛋白）在病毒脂质囊膜上形成纤突，具有血凝素和神经氨酸酶活性，其在病毒侵染过程中通过识别细胞受体，介导病毒吸附细胞膜，增强F蛋白的融合作用，并通过去除新合成病毒核衣壳蛋白上的唾液酸，对子代病毒粒子进行加工。HN基因是决定NDV的毒力、神经氨酸酶活性和血凝性等关键基因［7］。本研究对2013年从湖南长沙野鸭粪便中分离到的2株NDV弱毒株的F基因和HN基因进行扩增和测序，并对其核苷酸序列进行了遗传进化分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 NDV 分离株 HC911、HC984，2013年秋季分离自湖南长沙采集的野鸭粪便样本，由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所分离、鉴定、保存。

1.1.2 主要试剂 病毒 RNA提取试剂盒为BioFlux公司产品；反转录试剂盒AMV Reverse Transcriptase Kit为Promega公司产品；胶回收试剂盒E.I.N.ATMGel Extraction Kit为Omega公司产品；克隆载体pEASY-Blunt Cloning Kit、高保真DNA聚合酶TransStart Fastpfu DNA Polymerase为全式金公司产品；质粒提取试剂盒AxyPrep质粒小量制备试剂盒为AXYGEN公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取、反转录 取200μL分离株的病毒尿囊液，按照BioFlux公司病毒RNA提取试剂盒使用说明书提取病毒RNA，然后按照Promega公司反转录试剂盒AMV Reverse Transcriptase Kit使用说明进行反转录，得其cDNA。

1.2.2 RT-PCR 25μL反应体系中包括以下各组成分：5× Fastpfu buffer 10μL，dNTP（2.5mm）5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板（cDNA）2μL，ddwater 5μL，酶1μL。PCR扩增程序：95℃3min；95℃20s，50℃20s，72℃1min，共40个循环；72℃5min，4℃结束反应。取5μL PCR扩增产物，10g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定结果［8］。

1.2.3 PCR产物胶回收、克隆转化、质粒提取和序列测定 将PCR产物经胶回收纯化后，与pEASYBlunt Cloning Vetor进行连接、克隆转化，每个基因选择3个阳性重组单克隆，送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

1.2.4 F基因和HN基因进化树与同源性比较利用Lasergene软件对所测定的NDV毒株F基因序列和HN基因序列与ClassⅠ和ClassⅡ参考毒株［9］进行序列分析、核苷酸同源性比较。利用遗传进化分析软件MEGA6，采用Neighbor joining方法和Bootsrap值为1 000构建2株NDV毒株的F基因和HN基因的系统进化树［3］。

2 结果

2.1 HN基因和F基因的PCR扩增

经琼脂糖凝胶电泳，HN基因和F基因PCR扩增产物大小分别为2 054bp和1 694bp（图1）。

2.2 F基因序列和遗传进化分析

序列分析表明，2株NDV分离株HC911和HC984F基因编码区核苷酸长度为1 662bp，编码553个氨基酸，见表1。F基因碱性裂解位点序列为112E-R-Q-E-R-L117，与典型的NDV弱毒株的裂解位点序列特征一致，但是与减毒疫苗株La Sota的F蛋白裂解位点氨基酸序列112G-R-Q-G-R-L117不同。F蛋白氨基酸序列中存在5个潜在糖基化位点分别为85、191、366、471、541位，相对参考株缺少第447位潜在糖基化位点。

同源性分析表明，HC911、HC984与ClassⅠ类毒株之间核苷酸同源性在92.3%～93.8%之间，氨基酸同源性在94.4%～96.9%之间。

F基因遗传进化分析表明，HC911、HC981与我国首次分离到的ClassⅠ型NDV08-004同属于Genotype 3型，分离株与参考株F基因核苷酸序列间的系统进化树见图2。

表1 NDV分离株F蛋白氨基酸序列Table 1 The amino acid sequence of F protein of NDV isolates

图2 NDV分离株与参考株F基因核苷酸序列间的系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree analysis of F gene between NDV isolates and reference strains

2.3 HN基因序列和遗传进化分析

序列分析表明，HC911和HC984的HN基因编码区核苷酸长度为1 851bp，编码616个氨基酸（表2）。同时，其氨基酸序列中存在4个潜在糖基化位点，分别是第49、119、341、433位。

同源性分析表明，HC911、HC984与ClassⅠ类毒株之间核苷酸同源性在91.6%～93.9%之间，氨基酸序列同源性在90.8～95.5%之间。

HN基因遗传分析结果与F基因遗传进化树一致，也属于Genotype 3型，NDV分离株与参考株HN基因核苷酸序列间的系统进化树见图3。

表2 NDV分离株HN蛋白氨基酸序列Table 2 The amino acid sequence of HN protein of NDV isolates

图3 NDV分离株与参考株HN基因核苷酸序列间的系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree analysis of HN gene between NDV isolates and reference strains

3 讨论

F基因作为NDV的主要结构基因，与多种生物活性有关，是决定病毒毒力的关键因子。本研究分析的2株NDV分离株的F基因裂解位点的序列为112E-R-Q-E-R-L117，具有典型的NDV弱毒株特征。

糖基化位点在病毒糖蛋白折叠、蛋白质水解过程中发挥重要作用。但是研究表明，F基因单个或者多个糖基化位点的缺失对F蛋白表达几乎不产生影响，同时也不影响F蛋白转运至细胞表面［10］。大部分ClassⅠ类NDV毒株的F蛋白潜在糖基化位点有6个，即第85、191、366、447、471、541位。Sa-mal S等［11］还发现这些位点突变都不会对F蛋白碱性裂解位点产生影响。HC911和HC984的F蛋白第447位潜在糖基化位点的缺失不会对其致病性和毒力产生影响，其仍为弱毒株。

HN基因开放性阅读框长度影响HN蛋白结合含有唾液酸的受体的能力［12］。含有616个氨基酸的HN蛋白目前仅在NDV弱毒株中发现，而含有571个氨基酸的HN蛋白只在强毒株中检测到，但是NDV毒力的强弱主要还是由碱性裂解位点决定的。HC911和HC984的HN基因编码616个氨基酸，与遗传进化分析结果相一致［13］。

根据遗传进化分析表明，HC911和HC984属于ClassⅠ类Genotype 3型，该基因型在水鸟中曾被发现，说明该病毒可能通过野鸟—家禽的模式在自然界中循环。更重要的是，有研究证明ClassⅠ经气囊连续传代后可转变为强毒株［14］，这就要求我们将ND及其宿主作为日常监测的重点予以加强，同时，有条件的地区可以针对ND开展专项监测工作。

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