Geminin：一个潜在的肿瘤治疗靶点

郭建强(综述)，李素娟(审校)

(内蒙古医科大学附属医院 1心血管内科， 2消化内科，呼和浩特 010050)

理想的肿瘤治疗应该能够特异性地靶向肿瘤细胞而不损伤正常细胞。尤其是分子靶向治疗，近年来已受到密切的关注，并在临床实践中取得了良好的疗效。分子靶向治疗，是针对某一特异位点(如细胞内部的一个蛋白分子)来设计相应的治疗药物，药物进入细胞内作用于该位点，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。新近发现的小分子蛋白细胞周期因子Geminin，能够调控DNA的复制，其功能在正常细胞和肿瘤细胞中存在显著的差异，有望成为新的肿瘤治疗靶点。

1 Geminin的分子结构及基本功能

1.1Geminin的分子结构 Geminin是一个相对分子质量为25×103的核蛋白，N末端包含一个和细胞周期蛋白破坏框同源的短氨基酸序列(RRTLKVIQP)，这个序列开始于第33个氨基酸残基，为泛素化位点；Geminin的中心部位第118～152位的氨基酸序列能够形成卷曲螺旋结构域，此结构域含有5个7肽重复单位，是蛋白质与蛋白质相互作用的位点。Geminin第50～116之间的碱性氨基酸簇是一个核定位信号域[1]。Geminin是转录因子E2F的靶基因，它的表达受pRb/E2F通路的调节。E2F在行使其转录活化因子作用前必须与肿瘤抑制因子pRb分离，非磷酸化的pRb与E2F形成的复合物起抑制转录的作用，pRb磷酸化后释放E2F，启动Geminin基因的转录[2-3]。

1.2Geminin的基本功能 Geminin在DNA复制的起始发挥作用，抑制DNA的重复复制，维持基因组的稳定性。在细胞增殖过程中，确保基因组的稳定性与完整性是至关重要的，细胞必须保证在一个周期内，DNA仅被复制一次，这一过程主要是由前复制复合物(pre-replicative complex,pre-RC)周期性地形成和解离来实现。DNA复制的起始需要一些被称为复制许可因子的蛋白质连续结合到染色质上，其过程如下：在Cdc6(cell division cycle 6)、Cdt1和复制起始因子ORC(origin recognition complex)的协同下，有解旋酶活性的微小染色体维持蛋白2-7(mini chromosome maintenances protein 2-7,Mcms2-7)结合到染色质上，与Cdc6、Cdt1和ORC共同组成pre-RC，结合到染色体的复制起始点，DNA解螺旋，在DNA聚合酶等的作用下，DNA复制启动。DNA复制启动后，上述各个因子便会通过不同途径失活，保证在一个细胞周期内DNA仅被复制一次[4-5]。Geminin可通过抑制Cdt1的功能，确保DNA仅被复制一次。

最初研究发现，Geminin能够抑制DNA的复制，主要在DNA复制的起始发挥作用，其机制是通过阻止微小染色体复合物Mcms结合到染色质上[1]。随后研究发现，Geminin抑制DNA复制的功能是通过在S期与Cdt1的结合，从而阻止Mcms结合到染色质上[6]。Cdt1被认为是复制许可因子中最重要的蛋白质，因此对Cdt1的调控在细胞复制调控中尤为重要。Geminin可以阻遏Cdt1的作用，抑制DNA的复制，DNA复制开始后，Geminin便与Cdt1结合，而这种结合阻遏了Mcms2-7装载到染色体上，从而使pre-RC从染色质上解离，抑制DNA复制的再次启动。

在HeLa细胞和人乳腺癌细胞系中采用G/S-TdR双阻断法同步化细胞于S期早期然后释放，通过不同的时间点收集细胞，用免疫印迹法检测Geminin蛋白的表达，同时用流式细胞技术检测细胞周期的时相，发现Geminin表达于S期、G2期和大部分M期，在G1期不表达。进一步发现Geminin是由后期促进复合物泛素化途径在M期的后期降解，在早S期，APC失活，Geminin开始重新表达[1,7]。Geminin特异性的表达于细胞周期S期的特点也说明其主要功能是在S期调控DNA的复制。

2 Geminin在肿瘤中的表达及其在肿瘤预后判断中的作用

研究表明，Geminin能够抑制非洲爪蟾卵的DNA复制及其细胞周期的进程，因此认为其能够抑制细胞的增殖并且是一个肿瘤抑制基因[1]。后续的研究表明，Geminin主要在机体处于不断增殖状态的细胞中高表达，如淋巴细胞、雄性生殖细胞及上皮细胞，而处于静止的细胞(如心、神经、肾、肺)或静止细胞中，Geminin的表达水平则较低甚至不表达[8-9]。与正常细胞相比，肿瘤细胞以及肿瘤来源的细胞系，Geminin普遍存在高表达，并且其表达水平与肿瘤的增殖活性是相关的[10-12]。在少突胶质细胞瘤中，Geminin的表达不但被上调，而且Geminin的标记指数和Ki67(一种增殖细胞相关的核抗原，常被作为细胞增殖的标志分子)的标记指数存在相关性[13]。由于Mcm2、Ki67、Geminin表达于细胞周期的不同阶段，联合检测三个指标可以确定肿瘤细胞群细胞周期的分布特点，综合评估Mcm2、Geminin和Ki67的标记指数可以更好地界定肿瘤的增殖状态，以及更好地预测患者的预后[14]。Geminin的表达水平还可作为胶质母细胞瘤预后独立的预测因子，并且能够评估处于增殖状态的肿瘤细胞亚群，由于处于增殖状态的肿瘤细胞对放疗和化疗敏感，Geminin可指导胶质母细胞瘤放疗和化疗[15]。Geminin标记指数可作为胰腺内分泌肿瘤新的预后指示因子[16]。与正常人相比，急性白血病患者的骨髓中Geminin的表达水平显著升高[17]。Geminin在肺癌(腺癌型)中是过表达的，其标记指数与组织学分型及肿瘤分期等肺癌(腺癌型)临床病理相关，并且是一个有价值的预后指示分子[18]。Geminin的表达水平还能评价人软组织肉瘤的预后[19]。Geminin在唾液腺癌中是高表达的，并且能够预测肿瘤的侵袭性及临床预后[20]。上皮细胞间质化是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，也是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[21]。最近研究表明，Geminin能够通过影响Wnt通路和上皮钙黏素的表达而影响上皮细胞间质化过程[22-23]。

Geminin在乳腺癌中的作用得到了充分的研究。在原发性乳腺癌发生的早期，Geminin在病发部位损伤区即已经过量表达。Montanari等[24]在人的乳腺癌细胞中转染表达野生型Geminin质粒，建立稳定过表达Geminin的细胞系，发现过表达Geminin基因的细胞生长能力显著增加，表现为细胞的倍增时间缩短，饱和密度和贴壁率增加，处于S期细胞的比例增加，锚定生长能力是一个重要的肿瘤生长特性，对于过表达Geminin基因的乳腺癌细胞，其锚定生长能力显著增加。三阴乳腺癌特指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性的乳腺癌患者。在三阴性乳腺癌中，Geminin是过表达的，并且与肿瘤干细胞的标记蛋白CD133有很强的相关性，这对于乳腺癌恶性程度的分子分层非常有用[25]。过表达Geminin的乳腺上皮细胞能够在SCID小鼠中发展形成乳腺肿瘤并且维持其生长，进一步的研究表明，Geminin的这种诱导恶性转变作用通过抑制极光激酶B(Aurora B，AurB)的活性而实现，AurB能够活化多种参与染色质凝集分离过程的蛋白质，其抑制剂也是一类重要的抗肿瘤药物，实验表明，Geminin过表达能够使乳腺上皮细胞增加对AurB抑制剂的抵抗性，因此抑制Geminin的活性能够增加细胞AurB抑制剂的有效性[26]。

上述研究表明，Geminin在多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中均存在高表达，其表达水平对肿瘤患者的预后具有指示作用，Geminin在肿瘤的发生及发展过程中具有重要的作用。

3 降低Geminin的表达水平对细胞的影响

最初在非洲爪蟾胚胎的实验研究表明，利用反义寡核苷酸技术下调爪蟾胚胎Geminin的表达后，胚胎细胞停止在G2期，进一步的机制研究表明，缺乏Geminin的细胞未能进入M期是由于激活了Chk1(checkpoint kinase 1)依赖的细胞周期检验点而引起细胞周期的停止[27]。在果蝇胚胎细胞系SD2应用RNA干扰技术下调Geminin的表达引起了DNA的重复复制，出现大量六倍体甚至八倍体的细胞，在这些细胞中掺入5-溴脱氧尿嘧啶核苷，发现这些细胞仍在进行着DNA的复制，同时应用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚标记细胞核发现这些细胞出现了巨大的细胞核[28]。这些研究结果表明，Geminin在DNA复制的稳定性上具有重要的作用。

Geminin对于真核细胞DNA复制的调控作用也得到了广泛的研究。在人骨肉瘤细胞系U-2OS、人结肠癌细胞系(HCT116)作关于Geminin功能的研究表明，下调Geminin会导致这些细胞发生DNA重复复制，出现多倍体细胞和巨大的细胞核，细胞周期停止于G2期，同时也发现Chk1依赖的细胞周期检验点也是激活的，用咖啡因和7-hydroxystaurosporine(UCN-01)废除Chk1依赖的细胞周期检验点活化，这些异常DNA复制的细胞进入M期，但无法完成有丝分裂，随后发生细胞死亡[29]。另一项研究表明，在HCT116和人肺癌细胞系(H1299)利用RNA干扰技术下调Geminin的表达会导致DNA的重复复制，同样出现了大量超过四倍体的细胞，这些细胞展现出了巨大的细胞核，DNA的重复复制激活了G2/M细胞周期检验点，细胞周期停止于G2期，同样，废除G2/M细胞周期检验点的活化也引起了细胞的凋亡，同时下调Geminin的靶作用蛋白Cdt1可以阻止细胞发生DNA的重复复制[30]。近期研究显示，在人骨肉瘤细胞系U-2OS敲低Geminin表达的细胞都可以完成大部分S期的进程，DNA重复复制主要发生在晚S期和G2期[31]。

在正常细胞中，Geminin对于DNA复制的调控作用似乎并不是必要的。Geminin主要表达于细胞周期的S期和G2期，在M期的后半段由后期促进复合物泛素化途径降解，所以Shreeram等[32]构建了一个泛素化破坏框突变的非降解的Geminin表达质粒，转染人骨肉瘤细胞U-2OS和人胚胎成纤维细胞IMR90，发现可诱导前者的凋亡，而对后者则没有影响。在正常组织来源的血管平滑肌细胞改变Geminin的表达水平对其增殖没有影响[33]。Zhu等[34]更进一步地对比了多种肿瘤细胞系及正常细胞系Geminin功能差异，该研究选择了来源于结肠、乳腺、肺、肾脏、骨、脑、皮肤的正常细胞系和对应的肿瘤细胞系，发现小分子干扰RNA介导的Geminin表达下调导致DNA重复复制、细胞增殖停止仅在肿瘤细胞系中发生，而在正常细胞系中则没有观察到这一现象。由此可以得出，对于正常细胞DNA的复制，Geminin并不必要。

4 小 结

综合目前的研究结果可以看出，Geminin在肿瘤的发生、发展中具有重要的意义，不仅在肿瘤细胞及肿瘤组织中高表达，能够用来评价肿瘤的进程及预后，而且降低Geminin的表达水平对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用。但在正常细胞中，降低Geminin的表达水平对细胞的生长似乎并没有影响。靶向Geminin的治疗可能是一个理想的肿瘤治疗方案，可以利用RNA干扰等基因沉默技术，降低细胞Geminin的表达水平，这样可以抑制肿瘤细胞的生长而不影响正常细胞的生长，从而达到靶向治疗肿瘤的目的。

[1] McGarry TJ,Kirschner MW.Geminin,an inhibitor of DNA replication,is degraded during mitosis[J].Cell,1998,93(6):1043-1053.

[2] Markey M,Siddiqui H,Knudsen ES.Geminin is targeted for repression by the retinoblastoma tumor suppressor pathway through intragenic E2F sites[J].J Biol Chem,2004,279(28):29255-29262.

[3] Yoshida K,Inoue I.Regulation of Geminin and Cdt1 expression by E2F transcription factors[J].Oncogene,2004,23(21):3802-3812.

[4] Machida YJ,Hamlin JL,Dutta A.Right place,right time,and only once:replication initiation in metazoans[J].Cell,2005,123(1):13-24.

[5] Fujita M.Cdt1 revisited:complex and tight regulation during the cell cycle and consequences of deregulation in mammalian cells[J].Cell Div,2006,1:22.

[6] Wohlschlegel JA,Dwyer BT,Dhar SK,etal.Inhibition of eukaryotic DNA replication by geminin binding to Cdt1[J].Science,2000,290(5500):2309-2312.

[7] Gonzalez MA,Tachibana KE,Chin SF,etal.Geminin predicts adverse clinical outcome in breast cancer by reflecting cell-cycle progression[J].J Pathol,2004,204(2):121-130.

[8] Wohlschlegel JA,Kutok JL,Weng AP,etal.Expression of geminin as a marker of cell proliferation in normal tissues and malignancies[J].Am J Pathol,2002,161(1):267-273.

[9] Eward KL,Obermann EC,Shreeram S,etal.DNA replication licensing in somatic and germ cells[J].J Cell Sci,2004,117(Pt 24):5875-5886.

[10] Hansel DE,Rahman A,Hidalgo M,etal.Identification of novel cellular targets in biliary tract cancers using global gene expression technology[J].Am J Pathol,2003,163(1):217-229.

[11] Xouri G,Lygerou Z,Nishitani H,etal.Cdt1 and geminin are down-regulated upon cell cycle exit and are over-expressed in cancer-derived cell lines[J].Eur J Biochem,2004,271(16):3368-3378.

[12] Montanari M,Macaluso M,Cittadini A,etal.Role of geminin:from normal control of DNA replication to cancer formation and progression?[J].Cell Death Differ,2006,13(7):1052-1056.

[13] Wharton SB,Hibberd S,Eward KL,etal.DNA replication licensing and cell cycle kinetics of oligodendroglial tumours[J].Br J Cancer.2004,91(2):262-269.

[14] Dudderidge TJ,Stoeber K,Loddo M,etal.Mcm2,Geminin,and KI67 define proliferative state and are prognostic markers in renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2005,11(7):2510-2517.

[15] Yousaf J,Hills C,Dixit S,etal.Markers of cell division cycle in glioblastoma:significance in prediction of treatment response and patient prognosis[J].Br J Neurosurg,2013.

[16] Aizawa M,Kojima M,Gotohda N,etal.Geminin expression in pancreatic neuroendocrine tumors:possible new marker of malignancy[J].Pancreas,2012,41(4):512-517.

[17] Zhang KH,Li GL,Liu ZZ.Expressions of cell cycle associated factors geminin and cdt1 in patients with acute leukemia[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(3):578-581.

[18] Haruki T,Shomori K,Hamamoto Y,etal.Geminin expression in small lung adenocarcinomas:implication of prognostic significance[J].Lung Cancer,2011,71(3):356-362.

[19] Hamamoto Y,Shomori K,Nosaka K,etal.Prognostic significance of Minichromosome maintenance protein 7 and Geminin expression in patients with 109 soft tissue sarcomas[J].Oncol Lett,2010,1(4):703-709.

[20] Yamazaki M,Fujii S,Murata Y,etal.High expression level of geminin predicts a poor clinical outcome in salivary gland carcinomas[J].Histopathology,2010,56(7):883-892.

[21] Lin F,Wang N,Zhang TC.The role of endothelial-mesenchymal transition in development and pathological process[J].IUBMB Life,2012,64(9):717-723.

[22] Emmett LS,O′Shea KS.Geminin is required for epithelial to mesenchymal transition at gastrulation[J].Stem Cells Dev,2012,21(13):2395-2409.

[23] Slawny N,O′Shea KS.Geminin promotes an epithelial-to-mesenchymal transition in an embryonic stem cell model of gastrulation[J].Stem Cells Dev,2013,22(8):1177-1189.

[24] Montanari M,Boninsegna A,Faraglia B,etal.Increased expression of geminin stimulates the growth of mammary epithelial cells and is a frequent event in human tumors[J].J Cell Physiol,2005,202(1):215-222.

[25] Di Bonito M,Cantile M,Collina F,etal.Overexpression of Cell Cycle Progression Inhibitor Geminin is Associated with Tumor Stem-Like Phenotype of Triple-Negative Breast Cancer[J].J Breast Cancer,2012,15(2):162-171.

[26] Blanchard Z,Malik R,Mullins N,etal.Geminin overexpression induces mammary tumors via suppressing cytokinesis[J].Oncotarget,2011,2(12):1011-1027.

[27] McGarry TJ.Geminin deficiency causes a Chk1-dependent G2arrest in Xenopus[J].Mol Biol Cell,2002,13(10):3662-3671.

[28] Mihaylov IS,Kondo T,Jones L,etal.Control of DNA replication and chromosome ploidy by geminin and cyclin A[J].Mol Cell Biol,2002,22(6):1868-1880.

[29] Melixetian M,Ballabeni A,Masiero L,etal.Loss of Geminin induces rereplication in the presence of functional p53[J].J Cell Biol,2004,165(4):473-482.

[30] Zhu W,Chen Y,Dutta A.Rereplication by depletion of geminin is seen regardless of p53 status and activates a G2/M checkpoint[J].Mol Cell Biol,2004,24(16):7140-7150.

[31] Klotz-Noack K,McIntosh D,Schurch N,etal.Re-replication induced by geminin depletion occurs from G2and is enhanced by checkpoint activation[J].J Cell Sci,2012,125(Pt 10):2436-2445.

[32] Shreeram S,Sparks A,Lane DP,etal.Cell type-specific responses of human cells to inhibition of replication licensing[J].Oncogene,2002,21(43):6624-6632.

[33] Guo J,Sun N.Cell cycle regulator geminin is dispensable for the proliferation of vascular smooth muscle cells[J].Sci China Life Sci,2013,56(8):731-738.

[34] Zhu W,Depamphilis ML.Selective killing of cancer cells by suppression of geminin activity[J].Cancer Res,2009,69(11):4870-4877.