水稻/再力花单、间作系统中作物对镉胁迫的叶绿素荧光响应及镉积累特征

梁开明，傅 玲，章家恩，3，杨 滔

(1华南农业大学农学院/热带亚热带生态研究所，广东广州 510642;2广东省农业科学院水稻研究所，广东广州 510640;3华南农业大学，农业部华南热带农业环境重点实验室/广东省高等学校农业生态与农村环境重点实验室，广东广州510642)

我国60%以上人口以稻米为主食，然而目前耕地环境污染问题日益突出.据测算，中国耕地重金属污染的面积占耕地总量的1/6左右，8种土壤重金属元素中，Cd污染概率为25.2%，远超过其他几种土壤重金属元素［1］.Cd污染直接导致农作物的减产和粮食的Cd超标.2012年刘冬英等［2］对广东省以及华东、华中、东北、西北、西南等地的200份大米样品抽取测定，结果表明200个样品中Cd含量超标的达7.5%.

植物修复是治理污染土壤的重要手段之一，具有费用低、对环境影响小等优点.在植物修复技术中，间作模式在清除重金属污染物方面具有显著的生态和环境效益.Wu等［3］研究表明，将低累积作物玉米与重金属超富集植物套种，超富集植物提取重金属的效率比单种超富集植物明显提高，同时生产出的玉米籽粒重金属含量符合食品和饲料卫生标准，这种治理方法既不需要间断农业生产同时也较经济合理.国外已研究发现多种镉超积累植物，但相关研究成果多数适用于矿区、城郊等高污染区域，而且研究多数集中在旱地，而对污染程度较低的稻田研究较少.对于轻度污染的农田如果放弃作物生产全部种植富集植物，将影响粮食生产.因此，如果能够在农田引入功能植物与水稻间/混作，实现边生产边修复，将对环境保护和水稻生产具有积极作用.

再力花Thalia dealbata为多年生挺水植物，具有根系发达、生物量大、耐污染和净化能力强等特点，近年来被广泛用于污染河流的生态修复［4］.研究表明，再力花成熟植株的根系表面积在1 400 cm2以上，对 Cu、Mn、Zn、P 有良好的富集作用［5］.目前有关再力花对Cd污染胁迫的耐受性及其对Cd吸附特征的研究鲜见报道.

在植物修复中，植物对重金属的耐受性是影响污染环境修复效果的主要因素之一.高等植物光合作用对重金属胁迫的反应较为敏感，光合生理的变化是衡量植物对重金属耐受性的可靠标志［6］.Cd对光合作用具有多方面影响，高浓度Cd能破坏叶绿素结构，改变叶绿素组成以及影响卡尔文循环［7］.在光合作用过程中，光系统II(PSⅡ)反应中心的功能是限制光能利用和光合作用正常运行的关键环节，其活性对金属离子的胁迫尤为敏感［8］，而目前Cd对PSⅡ的影响机理仍处于探索阶段.在PSⅡ对逆境胁迫的研究中，叶片叶绿素荧光动力学参数可以在非离体条件下方便快速反映光合机构的光能吸收和转化、能量传递与分配、反应中心活性、过量能量耗散以及光合作用的光抑制等信息，在重金属逆境胁迫下植物的光合作用研究得到了越来越广泛的应用［9］.本研究将再力花与水稻在温室中进行单、间作处理，研究单作及间作模式下Cd对再力花和水稻叶片叶绿素荧光参数的影响，以揭示2种植物的光合系统对Cd胁迫的生理响应.同时通过研究间作模式下再力花对水稻根、茎、叶吸收Cd的影响及其自身吸收Cd特征，为其在农田Cd污染修复中的深入研究和应用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

水稻品种为黄华占Oryza sativa L.cv.Huanghuazhan，由广东省农业科学院水稻研究所提供.再力花Thalia dealbata Fraser ex Roscoe购自本地园林花卉公司.

供试土壤选用当地农田的水稻土.土壤基本理化性状:有机质 25.87 g·kg-1，全氮 1.154 g·kg-1，全磷 1.299 g·kg-1，全钾 24.04 g·kg-1，碱解氮132.19 mg·kg-1，速效磷 91.48 mg·kg-1，速效钾220.21 mg·kg-1.施用肥料分别为尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾，其中每1 kg土施用尿素0.2 g、磷酸二氢钾0.2 g、硫酸钾0.05 g.试验过程中的浇灌用水为当地饮用水，pH为8.02，Cd含量未检测出.

1.2 试验设计

试验以温室盆栽试验的方式进行.土壤风干，充分混合，过1 cm筛子，每盆装土8 kg.设置3种处理:水稻单作、水稻/再力花间作、再力花单作.污染物是以CdCl2·5H2O(分析纯)配制成的CdCl2水溶液，质量分数分别为0、1、10和25 mg·kg-1，分别为记为CK、Cd1、Cd2和Cd3，各处理重复4次.供试土壤加入Cd溶液后用去离子水浇灌，充分搅匀并使每盆土壤土层保持2 cm左右水层，平衡20 d后进行作物移栽.移栽时选取长势一致的植株，每盆移栽植株2株，水稻的移栽秧龄为4周，再力花移栽株高(15±1)cm.由于土壤和肥料的Cd含量未知，因此在平衡处理后重新测定各处理下土壤Cd含量(表1).

1.3 测定方法

1.3.1 叶绿素荧光参数的测定 在植株移栽20 d后，采用PAM-2500便携式荧光测定仪测定叶绿素荧光参数，每个处理取5片叶片重复.荧光参数主要包括:PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm);PSⅡ光合电子传递量子效率(YII);基于“沼泽模型”的光化学淬灭系数(qP);非光化学淬灭系数(qN和NPQ);PSⅡ非调节性能量耗散的量子产量(YNO);PSⅡ调节性能量耗散的量子产量(YNPQ).

表1 平衡后各处理土壤中Cd含量Tab.1 The contents of Cd in soil before transplanting mg·kg-1

1.3.2 快速光响应曲线的测定 完成叶绿素荧光参数测定后取同一叶片进行快速光响应曲线(Rapid light curves，RLCs)测定，0 ～2 000 μmol·m-2·s-1间由低到高共设11个光强梯度，相对电子传递速率(rETR)随光强的变化曲线即为快速光曲线，每个处理取5片叶片重复.

1.3.3 植株Cd含量的测定 作物种植70 d后取样分析植株不同部位重金属Cd的积累量.样品测定采用湿法(HNO3-HClO4)消解，用石墨炉原子吸收测定Cd含量，每个样品4个重复.

1.4 数据处理

采用SPSS统计分析软件包(SPSS 12.0 for Windows，Chicago，USA)对数据进行 One-Way ANOVA方差分析以及LSD多重比较.

2 结果与分析

2.1 不同处理下2种植物叶片的叶绿素荧光参数

图1A表明，Cd1处理下水稻和再力花叶片的Fv/Fm在单、间作下与CK均无显著差异.但随着Cd浓度增加，水稻叶片的Fv/Fm出现显著下降，Cd2和Cd3处理下水稻的Fv/Fm显著低于CK，Cd3处理下单作和间作下水稻叶片的Fv/Fm分别比CK处理下降了23.4%和21.9%，表明高浓度Cd胁迫下PSⅡ反应中心的光能转化效率受到显著抑制.而对于再力花而言，Cd2处理下，单作和间作下再力花Fv/Fm有所下降，但与CK差异未达到显著水平.而Cd3处理下单作和间作下再力花的Fv/Fm分别比CK降低14.8%和19.1%，降幅明显低于水稻.图1B表明低浓度的Cd处理对水稻叶片YII无显著影响，但中、高浓度的Cd处理显著降低了水稻叶片YII.Cd3处理下单、间作下水稻 YII均在0.30以下，分别比 CK低40.5%和43.4%，而单、间作下再力花YII分别比CK低19.3%和16.4%.图1C表明水稻叶片的qP随着Cd浓度增加显著下降，各浓度的Cd处理之间均存在显著差异(P＜0.05).而中、低浓度的Cd处理对再力花叶片qP的影响不显著，只有在Cd3处理下其qP显著低于其他处理，表明低浓度Cd胁迫下再力花叶片仍保持较高的光合电子传递活性.图1D和图1E表明，单、间作水稻叶片的qN和NPQ随着Cd浓度的增加而降低的趋势明显大于再力花.而在高浓度Cd处理下，再力花qN和NPQ降低的趋势明显低于水稻.随着Cd添加量的升高，水稻叶片YNPQ和YNO均显著升高.再力花叶片YNPQ在Cd1和Cd2处理下有所增加，但与 CK差异未达到显著水平(P＞0.05)，Cd3处理下YNPQ才出现明显的上升，而YNO则一直稳定在较低水平(图1F、1G).

图1 不同Cd浓度处理对水稻和再力花叶片叶绿素荧光参数的影响Fig.1 The effects of Cd stress on parameters of chlorophyll fluorescence in leaves of rice and Thalia dealbata

2.2 不同处理下水稻和再力花的相对电子传递速率光响应曲线

图2表明，在CK和Cd1处理下，单作和间作的水稻叶片光饱和点在800～1 000μmol·m-2·s-1附近，在Cd2和Cd3处理下，水稻叶片光饱和点下降至400～500 μmol·m-2·s-1附近，表明 Cd胁迫使水稻光响应能力显著降低.

高光强下单作和间作的水稻叶片rETR随着Cd浓度的增加均出现明显的下降.而CK、Cd1和Cd2处理下再力花叶片的rETR无显著差异，在Cd3处理下再力花高光强下的rETR才出现明显的下降，且在不同Cd处理下均高于水稻.

图2 Cd胁迫对水稻和再力花叶片相对电子传递速率(r ETR)光响应曲线的影响Fig.2 The effect of Cd stress on light response curves of relative electron transport rate(r ETR)in leaves of rice and Thalia dealbata

2.3 不同处理对水稻和再力花各器官Cd含量影响

表2表明，水稻体内Cd含量的分布规律为:根＞茎＞叶，随Cd浓度增大，各器官中的Cd含量相应增加.相同Cd处理下，同一器官在单、间作模式下Cd浓度存在一定差异，其中在Cd1和Cd2处理下，间作模式中水稻根部Cd含量显著低于单作;在Cd3处理下，间作水稻茎、叶部Cd含量显著低于单作，说明间作模式下水稻器官吸收的Cd含量有所下降.再力花体内的Cd含量分布规律为:茎＞叶、根，其中多数处理下根与叶之间含量差异不显著，但在Cd2和Cd3处理下表现为:叶＞根.随着Cd浓度的增加，再力花根、茎、叶中的Cd含量也相应增加.但在同一Cd浓度下相同器官的Cd含量在单、间作之间差异不显著.

表2 各处理植株体内不同部位Cd含量的测定1)Tab.2 The Cd contents in leaves，roots and stem s of rice and Thalia dealbata at different treatmentsmg·kg-1

表3表明，随着Cd浓度的增大，植株体内积累的Cd总量也逐步增加.在相同Cd浓度下，水稻体内Cd积累总量总体上是单作处理＞间作处理，且在CK、Cd1和Cd3处理下，单作和间作处理存在显著差异.再力花体内Cd总量变化基本趋势为:单作处理＞间作处理.而在相同Cd浓度下，对于间作处理中的2种作物中的Cd积累总量为再力花＞水稻，且2作物间的Cd积累总量差异达到显著水平.植株体内的Cd积累总量取决于该植株的生物量，由于再力花的生物量大，故可大大提高其积累Cd的总量，从而有效降低土壤Cd含量以及水稻体内的Cd积累总量.

表3 不同处理植株Cd积累总量1)Tab.3 The amount of Cd uptake by rice and Thalia dealbata at different treatments μg·株-1

3 讨论与结论

本研究结果表明，Cd对水稻和再力花的PSⅡ活性有明显的毒害效应，随着Cd浓度的上升，水稻和再力花的Fv/Fm和YII均呈不同程度下降，表明Cd胁迫下开放的PSⅡ反应中心数量减少，叶片原初光能捕获力下降.Fv/Fm下降通常与PSⅡ供体侧部的放氧复合体(OEC)在Cd胁迫下失活有关，Cd直接或间接与OEC的Mn2+、Ca2+及Cl-相互作用导致光合放氧速率降低，PSⅡ光合电子传递量子效率受到影响［10］.然而，在相同Cd胁迫条件下，再力花叶片的Fv/Fm和YII变化幅度相对较小，说明水稻对Cd胁迫反应更为敏感，而再力花叶片光合机构的损伤程度相对较低，其光能转化率高于水稻.正常条件下PSⅡ反应中心将捕获的光能转化为激发能，并将其中一部分转化为化学能从而推动碳同化反应，其余部分则耗散掉.然而，在某种胁迫条件下PSⅡ反应中心发生失活，成为一个能量陷阱，能吸收光能但不传递给电子传递链，以防止过剩光能产生激发而诱导活性氧的激增［11］.本研究表明随着Cd浓度的升高，水稻和再力花叶片的qN和NPQ值显著升高，qP随着Cd浓度增加出现下降，表明在Cd胁迫下PSⅡ反应中心开放部分光化学电子传递的份额减少，光能更多地以热的形式耗散，以避免光系统PSⅡ受到过剩光能的伤害［12］.随着Cd浓度的增加，水稻叶片的qN和NPQ降幅明显大于再力花，而再力花qP下降幅度明显低于水稻，说明再力花受到胁迫伤害程度低于水稻，叶片PSⅡ开放反应中心比例和参与CO2固定的电子更多.

RLCs曲线能有效度量光化学反应导致碳固定的电子传递情况［13］.本研究中水稻叶片光饱和点和rETR随着Cd浓度的增加而显著下降，表明Cd胁迫降低了水稻叶片的光能利用率和防御光抑制能力.而再力花叶片具有更高的光饱和点，表明在同样Cd胁迫下，其耐受光抑制的能力高于水稻，同时叶片具有较强的光合电子传递能力，能够更有效地将光解水产生的电子传递到PSI.YNPQ是PSⅡ调节性能量耗散的量子产量，YNPQ增加表明在光强过剩下植物将过剩光能耗散为热来减轻光合机构损伤.YNO则是衡量植物PSⅡ光损伤的重要指标，较高YNO反应光化学能量转换和保护性调节机制(如热耗散)不足以将吸收的光能完全消耗，表明光合机构可能已经受到损伤［14］.本研究结果显示，随着Cd添加量的升高，水稻叶片YNPQ和YNO均显著升高，一方面表明叶片通过热耗散消耗过剩的光能来减弱PSⅡ的光抑制，另一方面表明高浓度Cd胁迫已对水稻的PSⅡ造成一定程度的损害，导致叶片吸收的光量子以非调节性能量耗散的份额增加.而对于再力花，随着Cd添加量的升高，YNPQ升高、YNO则一直稳定在较低水平，表明其调节性能量耗散机制发挥着主要作用.

大量研究表明，选择适当的植物形成间套作复合体系可适当减少作物对重金属的吸收.Gove等［15］研究表明Zn超富集植物天蓝遏蓝菜Thlaspi caerulescens与大麦间作减少了大麦对Zn的吸收.Whiting等［16］研究表明锌超富集植物天蓝遏蓝菜和非超富集植物菥蓂Thlaspi arvense互作在添加Zn的土壤上可减少菥蓂对锌的吸附.Liu等［17］研究表明Cd富集植物油菜与中国白菜间作降低了中国白菜对Cd的吸收量.间作体系由于改变了作物根系分泌物和根际环境，而根系分泌物［18］以及土壤 pH［19］、土壤酶活性［20］、根际周围土壤中微生物种群分布［21］等环境因子对土壤重金属的有效性以及植物对重金属的吸收具有重要影响.本研究中，在同一Cd浓度处理下，相同植株部位中，单作处理水稻的根、茎、叶的Cd浓度总体上高于间作处理，表明水稻/再力花间作降低了水稻植株体的 Cd吸收，这与李新博等［22］和黑亮等［23］的研究结果相近.已有研究表明，一些高生物量农作物通常富集水平一般，但生物量大，使得实际富集总量大，因此也具有作为修复植物的潜力［24］.由于再力花具有较高的生物量，能吸收较多的土壤Cd，同时其Cd含量主要积累在茎部，通过植株收获可有效去除土壤中的Cd.而叶绿素荧光分析结果表明再力花对Cd胁迫有较高的抗性，因此在Cd污染农田上通过再力花与水稻间作，一方面有利于减少水稻对Cd的吸收，提高水稻食用安全性，另一方面能起到清除土壤Cd的作用.今后将在大田环境中进一步开展相关研究，对再力花抑制水稻Cd吸收的机理还有待从间作后根际环境的物理化学变化来进一步阐明.

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【责任编辑周志红】