种禽场A亚群禽白血病病原学调查及分离株遗传进化分析

冯 敏，谭利强，代曼曼，郝建勇，秦建如，黄小容，廖 明，曹伟胜

(华南农业大学兽医学院/农业部兽用疫苗创制重点实验室，广东广州 510642)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类肿瘤性疾病［1］.依据病毒的宿主范围和交叉中和反应等将禽白血病病毒分为A～J 10个亚群，其中ALV-A、B、J为常见的外源性病毒;ALV-E为内源性病毒，无致病能力.最近，有报道称从我国芦花鸡中发现一个疑似新的亚群，初步命名为K亚群［2］.目前，禽白血病在我国已经呈流行趋势，几乎蔓延到了每个省份［3］.鸡群中禽白血病病毒感染情况复杂，A/B亚群、J亚群禽白血病病毒均有存在，并先后感染肉鸡、蛋鸡以及各种地方品系鸡［4］.上世纪七八十年代，ALV-A在世界上普遍流行，给养禽业造成巨大的经济损失，各大种禽公司花费数年时间才得以净化.虽然从近年的流行病学调查结果显示，我国的禽白血病病原主要为J亚群，少量存在 A、B、C 亚群［4-5］，但 ALV-A 的存在，必须引起我们足够重视.ALV-A以引发淋巴细胞瘤为主，但也能像ALV-J一样引发血管瘤［6-7］.国内多位研究者分别在不同时间段，不同地区，不同品种鸡群中分离到ALV-A，并且测定其全基因序列［3，7-10］，最近有从我国东北地区野生鸟类分离到ALV-A的报道［11］.广东地区5年前从肉种鸡场分离到1株ALV-A［12］.本研究拟针对广东地区部分种禽场，通过采取病毒分离的方式，了解A亚群禽白血病病毒在该地区种禽场的感染情况，以及毒株的变异情况，以期为广东地区禽白血病的综合防控以及净化工作提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料的来源与处理 被检样品来自2012年9月—2013年9月广东4个种禽场(A、B、C、D)的核心种鸡群，无菌采集翅静脉抗凝血1 561份.2 000 r/min 4℃条件离心12 min，无菌分离血浆，-80℃条件保存备用.

1.1.2 主要试剂 禽白血病病毒抗原检测试剂盒(ALV Ag Test Kit)为美国IDEXX公司产品;pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品;DNA提取试剂盒，DNA Gel Extraction Kit，Plasmid Miniprep Kit为OMEGA公司产品.ALV-A单抗由美国ADOL实验室惠赠;ALV-J单抗JE9由扬州大学兽医学院秦爱建教授惠赠.FITC标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司.FBS和Trypsin均为Gibico公司产品.DF-1细胞，感受态细胞DH5ɑ为农业部兽用疫苗创制重点实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离培养 将“1.1.1”中制备的血浆接种于24孔板的 DF-1细胞悬液中(1.7×105mL-1)，每孔接种50μL血浆，同时设DMEM阴性对照和接种已知病毒阳性对照各2孔.37℃ CO2培养箱中培养，待细胞长至单层，换为体积分数1%的FBS细胞维持液连续培养7 d后收获，冻融3次，5 000 r/min离心5 min，离心后的细胞上清液进行p27抗原ELISA检测，细胞沉淀用于提取禽白血病前病毒基因组DNA.

1.2.2 细胞培养物抗原ELISA检测 p27抗原ELISA检测按照禽白血病病毒抗原检测试剂盒(IDEXX)使用说明书进行.

1.2.3 前病毒DNA的制备和病毒核酸PCR的检测

根据p27抗原检测的结果，对应收集“1.2.1”中样品细胞上清液为阳性的细胞沉淀，按照SQ Tissue组织DNA试剂盒说明书制备禽白血病前病毒基因组DNA，-20℃条件保存备用.分别参照Fenton等［13］，Silva 等［14］，Smith 等［15］的方法，合成 A-F/A-R;B-F/BR;H5/H7引物用于检测 ALV-A，ALV-B，ALV-J，其扩增产物预计大小分别为690、1 100、545 bp.

1.2.4 间接免疫荧光试验(IFA) 将p27抗原ELISA检测为阳性、PCR检测为ALV-A阳性的样品细胞上清液接种于铺满单层DF-1细胞的24孔板内，培养7 d后，底层细胞用PBS洗3次，用体积分数为4%多聚甲醛固定20 min.再用PBS洗涤3次，加入1∶200稀释的ALV-A单抗，4℃条件下孵育过夜.然后PBS洗涤3次，加上1∶200稀释的羊抗鼠IgGFITC荧光抗体，37℃作用1 h，再用PBS洗涤3次后，加1滴体积分数50%甘油覆盖细胞，在荧光显微镜下观察试验结果.设立一个DMEM阴性对照.按照同样方法用 ALV-J单抗 JE9对 PCR同时扩增出ALV-A/J目的片段的样品进行间接免疫荧光试验.1.2.5 ALV-A分离株前病毒全基因扩增和测序参考张小桃等［12］GD08全基因核苷酸序列扩增引物，采用分段扩增的方法，分别扩增分离株基因组核苷酸序列A、B、C段.阳性菌液送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序.

1.2.6 基因组核苷酸序列分析比较 利用DNAStar7.1基因分析软件对测序结果进行核苷酸序列的剪辑和拼接.将分离株的LTR、gp85基因核苷酸序列与国内外各参考毒株相同区域核苷酸序列进行相似性分析，并用MEGA5.0绘制分离株与各参考毒株的gp85基因序列的系统进化图谱.各亚群参考毒株分别为: ALV-A: ＲSA ( M37980 ) ，ＲAV-1 ( M19113 ) ，MAV-1( L10922. 1) ，GD08 ( HM775328) ，SDAU09E1( HM452341 ) ，SDAU09E2 ( HM452342 ) ，SDAU09C1( HM452339 ) ，SDAU09C3 ( HM452340 ) ，MQNCSU( DQ365814) ; ALV-B: ＲAV-2 ( M14902) ，SDAU09C2( HM446005 ) ; ALV-C: PragueC ( J02342 ) ; ALV-J:HPＲS103 ( Z46390 ) ，NX0101 ( DQ115805 ) ，HN06( HQ900844 ) ; ALV-E: ＲAV-0 ( M12172 ) ，SD0501( EF467236) . 以上参考株序列均来自GenBank 数据库，括号内为登录号.

2 结果与分析

2.1 细胞培养物抗原ELISA检测

依据IDEXX公司禽白血病病毒抗原检测试剂盒说明书，对冻融后的接种血浆试验组和对照组细胞上清液进行禽白血病病毒p27抗原检测，结果显示，总计1 561份血浆样品中，有71份样品呈阳性反应(表1)，其中A、B、C种禽场的外源性ALV阳性率均超过种鸡群健康标准1%.

2.2 病毒基因PCR检测

以“1.2.3”制备的阳性样品前病毒DNA作为模板进行分型PCR检测.凝胶电泳结果显示，其中来自C种禽场2份样品扩增出约690 bp的片段，与ALV-A预计的目的片段大小相符(图1).这2份样品其中1份还扩增出J亚群ALV 545 bp目的片段，显示为ALV-A/J共感染.阴性对照组DF-1细胞DNA中未扩出相应大小的目的片段.其余p27抗原检测阳性样品PCR检测均显示为ALV-J感染.

表1 4个种禽场外源性禽白血病病毒检出情况Tab.1 Exogenous avian leucosis virus detection of four breeder farms

图1 ALV-A PCR检测Fig.1 ALV-A PCR detection

2.3 间接免疫荧光检测

用ALV-A单抗做间接免疫荧光试验呈阳性反应(图2a、图2b)，细胞表面及胞浆呈现明显绿色荧光，对照组细胞(图2c)没有绿色荧光.间接免疫荧光试验结果进一步证明了分离到的2株病毒为ALV-A，分别命名为GD13-1、GD13-2.其中GD13-2 PCR能扩增出ALV-J的目的片段，用ALV-J单抗JE9做间接免疫荧光试验呈阳性反应(图2d)，对照成立(图2e)，结果提示GD13-2为ALV-A和ALV-J共感染.

图2 间接免疫荧光试验结果(100×)Fig.2 The result of IFA detection(100×)

2.4 分离株前病毒全基因组PCR扩增结果

按照“1.2.3”方法制备前病毒DNA，采用分段扩增的方法，分别扩增出大小为3.7、2.5、2.9 kb的3个目的片段，与预计片段大小相符(图3).

图3 分离株前病毒基因组PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results ofwhole proviral genome

2.5 分离株前病毒核苷酸序列分析

据报道ALV-A前病毒DNA全长约7.8 kb［16］，利用DNA-Star软件分别对ALV-A分离株GD13-1和GD13-2的3个扩增片段的基因序列进行剪辑和拼接分析后，发现GD13-1和GD13-2均具有典型的复制完全型反转录病毒基因组结构［17］;前病毒DNA全长分别为7 721、7 715 bp;gp85核苷酸序列长度均为1 017 bp;长末端重复序列(LTR)长度均为324 bp，相似性达到99.1%.

GD13-1、GD13-2与不同ALV-A分离株间LTR相似性比较发现，与SDAU09E2的LTR相似性最高，分别为96.9%和97.2%;与SDAU09E1的LTR相似性最低，分别为51.6%和52.3%，主要在U3区存在多处变异;与ALV-A美国株MQNCSU的LTR相似性分别为87.6%和87.2%;与广东分离株GD08的LTR相似性分别为88.9%和89.5%.

GD13-1、GD13-2与国内外不同禽白血病分离株gp85核苷酸序列进行相似性比较发现，这2个分离株的gp85与ALV-A的gp85相似性达81.6%～98.8%，而与 ALV-B、C、D、E、J亚群的 gp85 相似性只有47.5% ～85.4%.其中，这2个分离株与国外ALV-A分离株MAV-1相似性达89.3%;与国内分离株GD08的相似性分别达到了98.5%和98.8%，与SDAU09E2的相似性分别达到了98.4%和98.7%.各亚群的gp85系统进化树显示，这2个分离株与GD08、SDAU09E2位于同一个进化分支上，而与其他A亚群毒株位于同一个大的进化分支上(图4).

图4 GD13-1和GD13-2与不同亚群禽白血病病毒参考株间gp85基因遗传进化树关系Fig.4 Phylogenetic tree based on gp85 gene for GD13-1，GD13-2 and other avian leucosis virus reference strains of different subgroups

3 讨论

外源性禽白血病病毒不仅能引发肿瘤和死亡，还会引起鸡群免疫抑制和生长抑制等亚临床症状，给养禽业造成巨大损失.直到现在，依然没有有效的药物和疫苗来应对禽白血病的发生.西方国家防控该病的策略主要是通过不断剔除鸡群中的阳性鸡，达到净化种群的目的［18］.我国对禽白血病的研究起步较晚，有些养禽公司对该种病的重视不够，防控意识不强，一直没对种鸡群采取有力的净化措施.最近几年，主管部门和养禽行业开始意识到控制禽白血病的重要性，尤其是《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》［19］和《全国蛋鸡遗传改良计划(2012—2020年)》出台之后［20］，对禽白血病的防控起到推动作用.虽然现在我国J亚群禽白血病普遍流行，但依然存在ALV-A/B，且造成的影响不容忽视，并且有研究表明，禽白血病病毒不同亚群混合感染的现象也时有发生［5，21］.西方国家在上世纪80年代已经基本消除了经典的外源性ALV-A/B，但从我国进口的肉鸡祖代鸡中依然分离到了禽白血病病毒［22］.美国曾经报道过从马立克氏病疫苗中分离到了ALV-A［23］，我国生产的活疫苗不能保证没有存在类似的问题.鉴于以上情况，在积极推进种禽场白血病净化工作的进程中，开展不同亚群禽白血病病毒流行情况的调查，以及监测毒株的变异情况是非常有必要的.

本研究从广东4个种禽场共采集1 561份血浆样品，接种DF-1细胞，培养7 d后取上清液进行禽白血病病毒p27抗原检测，发现p27抗原阳性率为4.6%(71/1 561)，结果提示所调查的4个种禽场均有外源性禽白血病病毒感染.病毒基因检测引物PCR扩增和间接免疫荧光试验结果表明，只有来自C场的2份阳性样品扩增出ALV-A约690 bp目的片段，用ALV-A单抗做间接免疫荧光试验均呈阳性反应;其中有1份阳性样品前病毒DNA中还能检出ALV-J的特异性片段，用ALV-J单抗做间接免疫荧光试验也呈阳性反应;其余69份阳性样品均扩增出ALV-J 545 bp目的片段.调查结果表明广东地区种禽场内仍然存在A亚群禽白血病病毒感染，但ALV-A已经不是流行毒株.

分离株前病毒核苷酸序列分析结果表明，2株分离株GD13-1、GD13-2 gp85基因编码的氨基酸残基中有3个氨基酸的差异，GD13-2的gag基因在1 040～1 049位点连续有9个碱基缺失;LTR变异区主要集中在其中U3区，64位缺失1个碱基，多个位点存在点突变，但典型反转录病毒调控元件Y box、TATA box、CAAT box、CArG box、PRE box 未见任何变化.与A亚群原型株RAV-1 gp85核苷酸序列比对发现，2株分离株GD13-1、GD13-2存在多个地方的碱基缺失、插入突变和点突变;与早期广东分离株GD08 gp85基因编码的氨基酸序列进行比较，在58、119、125、134、222、243、332 位 氨 基 酸 有 差 异;与SDAU09E2 gp85基因编码的氨基酸序列比较，119、125、164、222位氨基酸有差异.遗传演化分析表明GD13-1、GD13-2 与 SDAU09E2、GD08 均有很高的相似性，提示这些毒株可能有共同的祖先.这些分离株不同位置出现的碱基突变、缺失和插入对分离株的生物学特性的影响有待进一步研究.同时，GD13-2与ALV-J混合感染的现象，说明部分种禽场禽白血病病毒感染情况相对复杂，为不同亚群禽白血病病毒重组创造了有利条件.本研究对广东地区部分种禽场进行了1次ALV-A感染的摸底调查，为下一步种鸡群白血病净化及有效防控提供了科学依据.

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【责任编辑柴 焰】