20味中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌活性研究

彭练慈，殷中琼，贾仁勇，2，李 莉，代如意，曲 径，刘明辉，陈 萍

(1四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014;2四川农业大学预防兽医研究所，四川雅安 625014)

无乳链球菌Streptococcus agalactiae又称B群链球菌(GBS)，可引起奶牛乳房炎，我国因无乳链球菌引起的奶牛乳房炎占总发病率的20% ～40%.目前，对于奶牛乳房炎的治疗主要依赖抗生素，由于反复大量使用，造成乳汁中抗生素残留日益严重，耐药菌株不断出现，使乳房炎的治疗效果不断下降［1-2］.

中草药具有调节畜禽机体免疫力、杀灭或抑制细菌和病毒等作用，并因其低毒、低残留、不易产生耐药性等特点越来越受到人们的重视［3］，从传统中草药中筛选出有效的抗无乳链球菌药物符合食品安全和公共卫生需要.本研究选取黄连Coptis chinensis等20味中药作为研究对象，以水和乙醇对其有效成分进行提取.通过测定黄连等20味中药提取物对无乳链球菌的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC)，筛选得到具有良好体外抗菌活性的中药提取物，然后通过棋盘稀释法［4-5］研究不同中药提取物两两联合对无乳链球菌的体外抑制效果，为进一步研制治疗奶牛乳房炎的中药组方制剂提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 无乳链球菌编号为CVCC1886，购自中国兽药监察所.1.1.2 药材 黄连(产地四川，批次:080406)、黄芩Scutellaria baicalensis(产地陕西，批次:040824)、乌梅Prunusmume(产地四川，批次:120315)、虎杖Polygonum cuspidatum(产地四川，批次:081102)、地榆Sanguisorba officinalis(产地陕西，批次:040827)、蒲公英Taraxacum mongolicum(产地贵州，批次:100217)、苦参Sophora flavescens(产地云南，批次:081121)、何首

乌Po.multiflorum(产地甘肃，批次:080301)、茵陈Artemisia scoparia(产地河北，批次:080923)、秦皮Fraxinus rhynchophylla(产地山西，批次:100330)、金银花Lonicera japonica(产地四川，批次:080919)、穿心莲 Andrographis paniculata(产地四川，批次:100310)、黄柏 Phellodendron chinense(产地四川，批次:080923)、艾叶 Ar.argyi(产地甘肃，批次:080921)、鱼腥草Houttuynia cordata(产地四川，批次:100310)、杜仲Eucommia ulmoides(产地云南，批次:080916)、连翘 Forsythia suspensa(产地四川，批次:100310)、白头翁Pulsatilla chinensis(产地四川，批次:100310)、夏枯草 Prunella vu lg aris(产地河南，批次:101114)、紫花地丁Violae yedoensis(产地四川，批次:100310)20味中药均购于四川雅安惠民堂药业连锁有限责任公司，由四川农业大学药学系副教授范巧佳鉴定为正品.

1.1.3 培养基 加有5%小牛血清的营养肉汤，鲜血营养琼脂培养基按照常规方法制作，用于无乳链球菌的培养.

1.1.4 仪器设备和试剂 电热恒温培养箱、超净工作台、旋转蒸发仪、索氏提取器、微量进样器、二甲亚砜、无水乙醇、T型涂布棒、90 mm玻璃培养皿.

1.2 方法

1.2.1 有效成分的提取 按照文献［6-16］的方法提取黄连等20味中药的有效成分，乌梅、黄连、黄芩、虎杖、蒲公英、茵陈、秦皮、黄柏、鱼腥草、紫花地丁、白头翁、何首乌、苦参、穿心莲、杜仲、连翘、金银花和夏枯草采用乙醇回流提取法，地榆和艾叶采用超声波提取法.各自合并滤液，浓缩制成浸膏，并计算浸膏得率.使用前将浸膏用适量二甲亚砜溶解，制成生药质量浓度为1 g/mL的药液，100℃流通蒸汽灭菌30 min，置于4℃冰箱备用.

1.2.2 细菌菌悬液的制备 挑取新鲜培养无乳链球菌的2个菌落接种于3 mL的肉汤培养基中，置于37℃恒温摇床中培养18～24 h后取出.吸取菌液0.5 mL，用生理盐水作 10-1梯度稀释，取 10-7、10-8、10-93个梯度的菌液0.1mL分别在6个鲜血琼脂培养基上均匀摊开，放入37℃恒温培养箱中培养18～24 h.计算出原液的细菌个数为1.6×1011CFU/mL.

临用前将菌原液用肉汤培养基稀释成菌液浓度为1.6×109CFU/mL.

1.2.3 体外抑菌试验 测定MIC:采用试管2倍稀释法，取18支灭菌试管，将其中16支分为试验组和阴性对照组，每组8支.18支试管分别加营养肉汤1 mL.在2组的第1管中分别加1 mL药液，混匀后吸取1 mL至第2管中，依次类推，直至第8管，第8管吸取1 mL弃去.然后，向试验组的8支试管中加0.1 mL的稀释菌液，阴性对照组8支试管不加菌液，加0.1 mL生理盐水.第17管不加药液加0.1 mL菌液作为阳性对照，第18管不加药液和菌液作为空白对照.则试验组和阴性对照组的第1管至第8管的药液浓 度 依 次 为 500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90 mg/mL.置于 37 ℃ 恒温摇床中培养18～24 h.以无菌生长的最低稀释度为MIC.

测定MBC:观察药物MIC以上未见细菌生长的各管培养物，分别各取0.1 mL移种至不含药物的鲜血营养琼脂平皿上，轻轻推开药液，置37℃培养过夜，观察有无细菌生长.平皿培养基中，计数少于5个菌落者作为该药的MBC［17］.

1.2.4 体外联合抑菌试验 根据单味中药的体外抑菌结果，选择其中抑菌活性较强的中药分别以其中2种药的 4MIC，2MIC，MIC，1/2MIC，1/4MIC 分别进行联合.以黄连与黄芩为例:用灭菌后的2 mL EP管50个，分为试验组和对照组.在第1～6行沿X轴(从左到右)每管中依次加入用肉汤稀释好的4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC 的黄连药液各 0.2 mL.以同样的方法在第1～6列沿Y轴方向(从上到下)每管中依次加入用肉汤稀释好的1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC的黄芩药液各0.2 mL，将两药混合均匀后加入制备好的菌液40μL，对照组加入等量的营养肉汤，其他操作同试验组.37℃培养18～24 h，观察结果.

结果判断依据:联合抑菌指数(Fraction inhibitory concentration index，FICI)=甲药联合时的MIC/甲药单独时的MIC+乙药联合时的MIC/乙药单独时的MIC.FICI≤0.5时为协同作用，0.5＜FICI≤1时为相加作用，1＜FICI≤2时为无关作用，FICI＞2时为拮抗作用.

2 结果与分析

2.1 20味中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌活性

20味中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌结果见表1.由表1可知，黄连、黄芩、乌梅、虎杖和地榆5味中药提取物的MIC的范围为7.80～31.25 mg/mL，MBC≤31.25 mg/mL抑菌效果最好.蒲公英、茵陈、秦皮、艾叶和紫花地丁5味中药提取物的MIC均为62.50 mg/mL，抑菌效果较好.黄柏等10味中药提取物的MIC均大于或等于125.00 mg/mL，抑菌效果较差.

表1 20种中药提取物对无乳链球菌的体外抑菌活性Tab.1 Antim icrobial activities of active ingredients extracts of twenty tradition Chinese medicines to Streptococcus agalactiae in vitro mg·mL-1

2.2 黄连等4味中药提取物对无乳链球菌的体外联合抑菌活性

通过单味药的体外抑菌结果，选择黄连、黄芩、虎杖和地榆进行体外联合抑菌试验，联合抑菌结果见表2.根据FICI值的判定依据，黄芩提取物与虎杖提取物、黄芩提取物与黄连提取物及黄连提取物与虎杖提取物对无乳链球菌的FICI≤0.50，为协同作用.地榆提取物与虎杖提取物及地榆提取物与黄芩提取物对无乳链球菌的FICI＞2，为拮抗作用.地榆提取物与黄连提取物对无乳链球菌的FICI=1，为相加作用(表2).

表2 4味中药两两联合用药对无乳链球菌的FICI1)Tab.2 The FICI to pairw ise combination of four herbs against Streptococcus agalactiae

3 讨论

中药成分复杂，提取其中的有效成分对于提高其药效具有重要作用.中药提取方法众多，其中乙醇回流法、超声波提取法因操作简单方便，适合试验操作而被广泛使用.

本研究根据20味中药的不同有效成分，分别采用乙醇回流法和超声波提取法对20味中药的有效成分进行提取［6-16］，沿用文献报道筛选的最佳工艺条件，使有效成分得到了极大的提取，从而保证了药效.

20味中药提取物的体外抑菌活性试验结果表明，虎杖、黄连和黄芩的 MIC分别为15.60、31.25、7.80 mg/mL，其MBC≤31.25 mg/mL说明黄连、黄芩和虎杖具有很强的抑菌作用.该结果与王庆玲等［17］和金建玲等［18］报道结果一致.抑菌活性好的地榆及抑菌活性较好的紫花地丁和蒲公英比金建玲等［18］报道的抑菌效果更优.本研究选取文献报道中筛选出的最佳提取工艺条件对黄连［6］、黄芩［7］、虎杖［8］等20味中药的有效成分进行提取，使提取物中的有效成分尽可能地多，从而达到了较好的抑菌效果.陈微等［19］报道夏枯草和黄柏对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有很好的抑菌活性，但在本研究中对无乳链球菌的抑菌效果并不好，可能因为不同的提取方法以及中药提取物的pH不同，对不同的细菌产生不同的抑菌效果，且提取物中不溶成分偏多，对中草药抗菌活性成分有一定的影响，使得抑菌效果不那么理想.

联合抑菌试验显示，黄连和黄芩、虎杖联合都产生协同作用，具有良好的抗菌作用.地榆和黄芩、虎杖联合都产生拮抗作用.地榆的有效成分是鞣质，具有大分子多元酚类结构，容易发生缩合反应或沉淀反应而失去相应的抗菌活性，与黄芩、虎杖联合后，3种有效成分发生化学反应，可能使药物的有效结构发生改变，导致联合后产生拮抗作用.

本研究表明，黄连、黄芩和虎杖联合产生协同作用，增强了抑菌效果，可以组成一个复方.本研究为抗无乳链球菌的中药组方提供参考.

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【责任编辑 柴 焰】