环孢素A在心肌缺血再灌注损伤中的心脏保护作用研究进展

张昌琳 综述 乔树宾 审校

(中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外心血管病医院冠心病诊治中心，北京 100037)

急性心肌梗死后，早期恢复心肌血液灌注可以限制梗死面积并改善临床预后。然而，再灌注本身可以造成心肌损伤，从而抵消急性心肌梗死后早期再灌注(通过溶栓或直接经皮冠状动脉介入治疗)的获益。这种现象为心肌缺血再灌注损伤。另外，对于窒息复苏后或接受心脏外科体外循环手术患者，同样存在心肌缺血再灌注损伤的情况。心肌再灌注时，线粒体通透性转换孔(mPTP)的持续性开放，在再灌注损伤中发挥着重要的作用[1]。环孢素A(CsA)是一种在器官移植中常用的免疫抑制剂，许多动物实验及部分小规模临床研究表明，其可以通过抑制mPTP而减少梗死面积[2]。然而，也有研究提示CsA并没有心脏保护作用。现就CsA在心肌缺血再灌注损伤中可能的心脏保护作用机制、相关的动物实验模型及临床研究、可能的影响因素及进一步研究方向进行综述。

1 CsA可能的心脏保护作用机制

1.1 mPTP途径

mPTP是位于线粒体内膜上的非特异性孔道，只允许0.15×104以下的分子通过。组织缺血再灌注后数分钟内，pH值迅速恢复、细胞内钙超载及活性氧的大量产生可引起mPTP开放，从而使溶质和离子通过该通道进入线粒体，线粒体基质肿胀、电化学梯度消失、呼吸链解耦联、ATP耗竭、线粒体外膜破裂、吡啶核苷酸丧失及促凋亡因子细胞色素C释放入细胞浆，最终导致细胞凋亡和(或)坏死[3]。

mPTP的主要构成成分还有待进一步研究。目前认为，mPTP的核心成分为腺嘌呤核苷酸转位酶与亲环素D(Cyp-D)[4-5]。Cyp-D具有肽基脯氨酰顺反式异构酶活性，它可于再灌注开始时引起mPTP的构象改变，最终形成孔道。Cyp-D基因敲除小鼠对mPTP开放具有高度抵抗性，这也强烈支持Cyp-D在mPTP形成中的作用[6]。而腺嘌呤核苷酸转位酶在mPTP中的作用还不清楚。

CsA是一种亲脂性的含有11个氨基酸的环形肽，相对分子量120.2×104。通常，CsA被用来与亲环素A相结合而在接受器官移植的患者中发挥免疫抑制作用。后来，许多研究表明CsA可通过与CyP-D的亲和力而抑制mPTP的开放，从而在缺血再灌注损伤中起到心脏保护作用[2，7]。

1.2 促进氯离子外流，加强细胞的容量调节作用

Diaz等[8]的研究表明在培养的兔心肌细胞接受模拟缺血75 min/再灌注60 min后，CsA除了抑制mPTP开放，还通过促进Cl－外流加强细胞的容量调节作用而减少心肌细胞坏死。

1.3 内质网应激途径

Belaidi等[9]报告，在心肌缺血再灌注中，抑制CyP-D产生的心脏保护作用不仅仅是由于抑制了CyP-D依赖性的mPTP开放，而且与抑制CyP-D而引起的适度内质网应激有关。尽管这种内质网应激所带来的心脏保护作用的具体机制还不明确，但可能包括抑制再灌注中钙离子由内质网向线粒体转移。

2 CsA在动物缺血再灌注损伤模型中的研究

2.1 CsA具有心脏保护作用

许多体内及体外研究表明CsA可防止缺血再灌注损伤、减少梗死面积及保留再灌注损伤后的心功能[10]。该类研究包括缺血前、缺血后或再灌注时应用CsA。目前，大部分研究都是在再灌注时应用CsA，因为mPTP是在再灌注时开放[7]。

2.1.1 CsA在急性心肌梗死缺血再灌注模型中的心脏保护作用

2002年，Hausenloy等[11]的研究第一次表明在心肌再灌注当时使用 CsA可减少梗死面积，证实了mPTP主要在心肌再灌注起始时开放。该研究对体外大鼠心脏通过阻闭或再通左主干，进行35 min缺血，随之120 min的再灌注，于再灌注前5 min开始应用0.2 μmol/L的CsA，共持续20 min。再灌注前5 min开始给药并持续20 min是为了保证再灌注开始时该药物可以立刻灌注心脏。病理结果显示CsA组比对照组心肌梗死面积明显减少[(18.0±1.7)%vs(44.7±2.0)%，P ＜0.000 1]。

Argaud等[12]通过对成年家兔左回旋支夹闭/开放而进行30 min缺血/4 h再灌注，并于缺血前10 min或再灌注前1 min静脉一次性给予CsA 10 mg/kg。结果表明，CsA组心肌梗死面积较对照组均明显减少，由对照组的60%减少到24%，而且心肌细胞凋亡也明显减少。另外，在CsA组中，引起mPTP开放所需的钙离子浓度也较对照组显著为高。该研究表明CsA通过抑制mPTP开放，可对急性心肌梗死后的再灌注心肌提供很强的抗坏死与抗凋亡性保护作用。

8～10 周的野生型小鼠前降支缺血再灌注模型，接受30 min缺血/120 min再灌注，于再灌注时立即给予CsA 10 mg/kg，结果表明CsA组较对照组心肌梗死面积明显减少[(32.3±3)%vs(48±4)%P＜0.05]。更重要的是在CyP-D基因敲除小鼠中，同样的CsA治疗方案不能减少梗死面积，表明mPTP在心肌再灌注损伤中的重要作用[13]。

Skyschally等[14]的研究表明，20 ～40 kg的小猪接受90 min前降支低灌注/120 min再灌注，于再灌注前5 min静脉给予5 mg/kg的CsA。结果显示:CsA组心肌梗死面积较对照组减少(24%vs 34%)。

2.1.2 CsA在其他缺血再灌注模型中的心脏保护作用

1～4 d的新生小猪在经历低氧状态(10% ～15%的氧气)2 h，随后100%纯氧吸入30 min/21%氧气3.5 h。于再氧合5 min时给予CsA 10 mg/kg。结果表明，与对照组相比，CsA治疗后的窒息小猪心肌标志物与脂质氢过氧化物更低[15]。而且，CsA治疗改善了线粒体顺乌头酸酶活性，降低了细胞质细胞色素C水平。进而，改善了的线粒体功能与心排血量显著相关。该实验是第一个表明窒息新生小猪复苏后应用CsA可减弱心肌与线粒体损伤的研究，而且是第一个应用大型动物模型来模拟分娩期新生儿窒息/再给氧的临床情况下，复苏后给予CsA治疗存在潜在的心脏保护作用。该研究于再给氧后5 min时应用CsA是为了模拟临床实践中需要时间对分娩后新生儿建立静脉通路以便给药。而且该研究团队在以往的实验中已经证实，在同样的实验条件下，CsA治疗可以在窒息新生小猪中带来剂量依赖性的心排血量、每搏量与循环氧运输能力的改善[16]。

与上述研究相类似，Cour等[17]发现兔在体心脏骤停15 min后，再灌注时静脉应用CsA(5 mg/kg)可以改善生存率、减少心肌坏死以及抑制心脏线粒体mPTP开放。该研究提示，在成功复苏后的心脏骤停患者中，应用CsA可能是有益的。

心脏外科体外循环手术中，与冠心病不同，心脏面临着全面缺血。虽然应用了心脏停跳液及低温来减低心肌损伤，但体外循环撤机时的再灌注损伤依然可能会发生。Oka等[18]对14 d大的新生小猪进行体外循环，并将其分为心脏停跳液+CsA(10 mg/kg)组与单用心脏停跳液组。结果表明，CsA治疗组线粒体结构及功能得到改善。提示CsA可能用来减轻心外科体外循环患者脱离体外循环机后的缺血再灌注损伤。

2.2 CsA在心肌缺血再灌注损伤中没有心脏保护作用

应用球囊阻塞左前降支的方法[19]，23头猪缺血40 min，随后再灌注4 h，于再灌注前7 min，随机接受一次性静脉注射2.5 mg/kg的CsA(n=12)或生理盐水(n=11)。结果显示，与对照组生理盐水相比，CsA没有能够减少梗死面积[(54±6)%vs(51±6)%，P=0.75]。同一研究团队在猪心肌缺血再灌注模型中应用类似的实验方案中，10 mg/kg的CsA同样没能减少心肌梗死面积[20]。而且与对照组相比，凋亡诱导因子蛋白表达在CsA治疗组更高。提示CsA的治疗不但没有保护作用，甚至可能有害。一项在体大鼠心脏研究同样表明[21]，于再灌注前5 min一次性静脉注射10 mg/kg的CsA，没有能较对照组减少梗死面积。

最近一项荟萃分析[22]纳入了20项在体动物(包括大鼠、小鼠、兔子及猪)心肌缺血再灌注模型研究。结果表明，总体上CsA能够减少心肌梗死面积。然而，在4项猪心肌梗死模型中，只有1项研究显示CsA有心脏保护作用，其余3项均为阴性结果。由于猪心脏与人类心脏相似(如冠状动脉解剖、侧支循环少及心肌质量)，CsA在猪心肌梗死模型中未能获得疗效，使得其在人类中可能的心脏保护作用受到质疑。

3 CsA在临床急性心肌梗死再灌注患者中的研究

目前有关CsA在接受再灌注治疗的急性心肌梗死患者的研究非常少。

Piot等[23]的一项小规模的概念验证性临床试验表明，介入治疗时给予CsA可减少心肌梗死面积，这也是CsA在急性心肌梗死中的第一项临床研究。发病12 h内的58例接受直接经皮冠状动脉介入治疗的急性ST段抬高性心肌梗死患者，被随机分入CsA组或生理盐水组。两组患者于直接支架术前10 min内分别通过静脉注射2.5 mg/kg的CsA或等量的生理盐水。结果，CsA组心肌梗死面积(通过测定肌酸激酶表示)较对照组明显减少。其中27名患者于发病5 d时接受了心脏磁共振检查，结果同样显示CsA组心肌梗死面积减少。同一组研究者于6个月后对上述人群进行了心脏磁共振随访[24]。结果表明，CsA减少心肌梗死面积的作用维持到了6个月，而且对左室重构无不利影响。另外，CsA减少心肌梗死面积的作用与发病5 d时较低的左室扩张有关，而且这种作用同样维持到了6个月。

近来，Ghaffari等[1]入选了101例发病6 h之内接受溶栓治疗的急性前壁ST段抬高性心肌梗死患者。在这项随机双盲临床试验中，患者随机分入2.5 mg/kg的CsA组或等量生理盐水组(溶栓前立即静脉注射)，并随访6个月。结果显示，两组间心肌酶释放、心律失常、心力衰竭、发病1 d及出院时的左室射血分数、住院期间或6个月时的病死率均无显著性差异。提示溶栓前应用CsA不能减少心肌梗死面积或改善临床终点。

目前，一项被称为 CIRCUS的研究(NCT 01502774)正在进行中。这是一项大规模、随机、双盲、安慰剂对照的临床研究，计划入选1 000例因急性ST段抬高性心肌梗死接受介入治疗的患者，以评估CsA的抗再灌注损伤的心脏保护作用。该实验结果将确立CsA在接受介入治疗的急性心肌梗死患者中是否具有有效的针对再灌注损伤的治疗作用。

4 CsA在缺血再灌注时发挥心脏保护作用可能的影响因素

4.1 合并疾病

Huhn等[25]的研究表明，既往有糖尿病史目前血糖正常的肥胖大鼠，对再灌注时应用CsA(5 mg/kg或10mg/kg)以减少心肌梗死面积的作用是抵抗的。

4.2 年龄

CsA可减少缺血再灌注损伤幼年大鼠(3～5个月)的心肌梗死面积，并显著延长诱发幼年大鼠心肌细胞mPTP开放所需的时间。而在老年大鼠(20～24个月)中却并未有上述作用[26]。

4.3 CsA剂量

CsA的治疗窗比较窄，在较低血浆浓度(0.5～2 μmol/L)时有效，而较高剂量(≥5 μmol/L)时有效性丧失[1]。近来一项关于在窒息/再给氧新生小猪中一次性静脉注射CsA的药代动力学研究表明，剂量越高，血浆药物浓度曲线下面积越大，最高药物浓度也越高，但与2.5 mg/kg及10 mg/kg组相比，25 mg/kg组使得血浆肌钙蛋白升高，反映该剂量加重了心肌损害[27]。

4.4 心肌缺血时间

Ruiz-Meana等[28]的研究表明，体外大鼠心脏缺血再灌注模型中，Cyp-D基因敲除大鼠在缺血30 min组较对照组心肌梗死面积增加，而缺血时间延长到60 min者，心肌梗死面积反而较对照组减少。核磁共振波谱分析提示，缺血30 min组磷酸肌酸恢复快，紧接着明显蜕变(与乳酸脱氢酶释放及细胞收缩有关)，应用收缩阻滞剂可以预防这种现象，但CsA却不能。相反，在缺血50 min后，CsA可以减少收缩、乳酸脱氢酶释放及梗死面积。表明，缺血时间决定了mPTP在缺血再灌注损伤中的重要性。在较短时间缺血中，其他机制(而不是mPTP)起到了重要作用，这对临床研究有着重要启示。

4.5 CsA应用时机

在研究CsA对心肌梗死疗效的动物实验中，缺血前、缺血中或再灌注时应用CsA的都有。如前述，目前大部分研究都是在再灌注时应用CsA，因为mPTP是在再灌注时开放[7]。

4.6 物种

如前述，近来进行的与人类心脏相似的猪心肌梗死模型，绝大部分都宣告失败，尽管有很多可能的其他原因，但物种间差别值得考虑[22]。

5 CsA的不良反应

长期应用CsA可能引起的不良反应包括:胃肠道反应、牙龈增生、心律失常、神经病变、震颤、多毛症、肾毒性与移植血管病[2]，另外由于免疫抑制作用引起感染及肿瘤的发生[22]。然而在缺血再灌注模型中单次应用CsA是否会引起上述不良反应，目前仍不清楚。窒息新生小猪的研究中，在单次应用CsA后，未观察到肾脏灌注、功能或损伤的不良反应[16]。Piot等[23]进行的第一项CsA在急性心肌梗死再灌注中的临床研究，未观察到单次静脉应用CsA 2.5 mg/kg后血压、肌酐、血钾、胆红素及白细胞计数等方面的差别。

6 未来进一步潜在的研究方向

6.1 CsA与缺血后适应联合

大鼠糖尿病缺血再灌注损伤模型中，单独应用CsA或缺血后适应操作(3个周期的30 s灌注/30 s缺血)均未能改善一氧化氮浓度或减少梗死面积。而联合应用CsA与缺血后适应可增加一氧化氮浓度并减少心肌梗死面积[29]。然而，也有研究表明，联合应用缺血后适应与CsA不能增加疗效[30]。

6.2 CsA与鱼藤酮联合

鱼藤酮是一种线粒体呼吸链复合物Ⅰ的抑制剂，单独应用鱼藤酮不能减少缺氧/再氧合损伤心肌细胞的死亡，但联合应用鱼藤酮与CsA可产生协同性的心肌细胞保护作用[31]。

6.3 CsA类似物

研究表明除了CsA外，其他mPTP开放抑制剂如Debio-025或NIM811也可减少动物缺血再灌注损伤模型中的心肌梗死面积，改善左室射血分数与生存率。上述两者均为CsA衍生物。Debio-025，也称之为阿拉泊韦，是一种用来抑制1型人类免疫缺陷病毒的新型亲环素抑制剂。它是通过去除CsA钙神经素结合域后获得，这就可以避免CsA的免疫抑制活性，而且与亲环素的亲和力增加。NIM811也是通过去除CsA钙神经素结合域以避免CsA的免疫抑制活性，其肾毒性较小[2]。

7 结论

CsA是一种主要用于器官移植后抗移植排斥反应的免疫抑制剂。目前的研究表明其可以通过与Cyp-D结合而抑制线粒体内膜上的mPTP开放，从而发挥其在心肌缺血再灌注损伤中的心脏保护作用。许多动物心肌梗死再灌注模型及少数急性心肌梗死临床研究证实再灌注时应用CsA可减轻心肌缺血再灌注损伤、减少梗死面积及保留再灌注损伤后的心功能。另外，CsA在接受心外科体外循环手术、窒息及心脏骤停复苏术后的动物模型中亦有类似的心脏保护作用。然而也有部分动物实验及新近发表的临床研究提示其没有心脏保护作用，甚至可能是有害的。许多因素可影响CsA对于心肌缺血再灌注损伤的保护作用，包括:合并的临床疾病如糖尿病、年龄、心肌缺血时间、物种、CsA剂量及应用时机等。长期应用CsA可能产生许多不良反应，新型CsA可能具有更好的安全性及对mPTP更高的亲和力。未来应该进一步明确CsA对于心肌缺血再灌注损伤保护作用的确切机制，确定影响其心脏保护作用的因素，从而设计出高质量的动物实验以及大规模的临床研究，尽快证实其有效性及安全性。必要时可进一步联合缺血后适应或其他药物来发挥其可能的心脏保护作用。

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