内翻性乳头状瘤中角蛋白免疫组化方法研究

王 辉，王 春，葛 莹，李 晨，孔 慧，孔 力

(1.大连医科大学 附属第二医院 耳鼻咽喉科，辽宁 大连116027;2.乌兰察布市中心医院 耳鼻咽喉科，内蒙古 集宁012000;3.大连医科大学 组胚实验室，辽宁 大连116044)

鼻腔、鼻窦内翻性乳头状瘤(sinonasal inverted papilloma，SNIP)以单侧发病为主，特征性地发生于鼻腔后壁中鼻甲区域和鼻隐窝，有学者认为其可能与胚胎期Schneiderian 膜(外胚层呼吸上皮)不正常异位有关。SNIP 的组织学特点表现为几乎全部是由被覆基底膜完整且明显增生的非角化鳞状上皮构成，向肿瘤基质内生长。

广谱细胞角蛋白CK，组成细胞骨架蛋白之一，广泛存在于人体上皮组织，而不存在于间叶组织中，早在1990年Moll 等［1］的研究报道，角蛋白分有40种，分为:I 型具有酸性等电点，相对分子量为40 ～56 kb，Ⅱ型具有中性或偏碱性，相对分子量为52 ～67 kb。CK 用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，亦有用于乳腺癌、结肠癌淋巴结转移检测的报告，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。不同文献报道SNIP 的复发率差别较大，从0% ～78%不等［2］，多为术后2年，有学者认为其与SNIP“多中心起源”相关［3］，也有专家认为SNIP 切除的彻底性是影响复发的主要因素［4-5］。因CK 在细胞转化过程中一般保持其亚微结构及免疫学特征，角蛋白类型可判断肿瘤组织学来源［6］。鼻腔黏膜及多数肿瘤，主要为鳞状上皮所覆盖，有研究指出SNIP 复发与瘤体部位和鳞状上皮增生有关［7-8］。目前的研究多仅限于镜下判断是否阳性，其强度多根据其范围、染色深浅用等级表示(如-，+，+ +，+ + +)。SNIP 尚未有利用图像分析仪计算具体数值进行阳性表达程度的比较方法。本研究利用Image-ProPlus 图像分析仪，测定染色区阳性反应的平均标准光密度值，探讨不同抗原修复条件对广谱细胞角蛋白(CK)阳性表达程度的影响，筛选优势抗原修复方法。

1 材料和方法

1.1 一般资料

实验标本来自2012年9月—2013年5月在大连医科大学附属第二医院接受手术治疗且经病理证实的11 例鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者，均无其他合并症。组织经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋后，连续切片，切片厚度为2. 5 μm。切片所用的载玻片为经防脱处理的APES 玻片，60 h烤箱中烤1 ～1.5 h。每例患者的标本取连续切片(4 片)，分为4 组进行不同修复方法，比较其阳性表达强度。

1.2 免疫组织实验试剂

细胞广谱角蛋白CK 工作液ZM-0069(北京中杉金桥);EDTA 抗原修复液(稀释50 倍，pH= 9.0)(北京中杉金桥);PBS 磷酸盐缓冲液(0.01M pH =7.2 ～7.4)(北京中衫金桥:当天配置);SP 试剂盒(北京中山生物);DAB 显色工作液(北京中山生物)。

1.3 实验方法

全部指标均应用免疫组织化学LSAB 法。阴性对照以PBS 代替一抗，皮肤组织切片作为CK 阳性对照。应用日本尼康光学显微镜拍摄图片，Image -Pro Plus 7.0 图像分析仪。

每张切片取5 个视野，平均计算200 个单位染色区域面积，测定染色区阳性反应的平均标准光密度值。实验过程如下:按实验修复条件不同分为4组:(1)高温高压EDTA 修复:切片置于高压锅中加入EDTA 加热至121.5 ℃(2 min)，冷却至室温;(2)高温高压柠檬酸钠修复:切片置于高压锅中加入柠檬酸钠加热至121.5 ℃(2 min)，冷却至室温。(3)微波EDTA 抗原修复液，切片置于微波炉加入EDTA 高火3 min，解冻15 min，放置至室温。(4)微波柠檬酸钠修复:标本置于微波炉加入柠檬酸钠高火3 min，解冻15 min，放置至室温。

1.4 统计学方法

2 结 果

如表1所示，SNIP 组织高温高压EDTA 修复CK 阳性表达强度明显优于其他3 种修复方法。应用相同的EDTA 修复液时，高温高压条件阳性表达强度增高(P ＜0.05)。高温高压条件下，EDTA 修复液(0.01 mmol/L pH=9.0)修复效果优于柠檬酸钠修复液(0.01 mmol/L pH =6.0)(P ＜0.05)。免疫组化图片见图1～4。

表1 阳性表达程度平均标准光密度值Tab 1 Positive expression of average level ( ± s)

表1 阳性表达程度平均标准光密度值Tab 1 Positive expression of average level ( ± s)

1)与其他3 种修复方法比较，P ＜0.05

修复条件 修复液平均标准光密度值高温高压EDTA 修复液 0.365464 ±0.02329881)柠檬酸钠修复液 0.323518 ±0.0511906微波EDTA 修复液 0.324955 ±0.0557229柠檬酸钠修复液0.302555 ±0.0614531

3 讨 论

免疫组化是目前临床应用最为广泛的病理辅助诊断之一，它应用抗原抗体特异性结合原理，标记的抗体与显色剂结合、在组织切片上显示原位组织细胞内抗原以及抗原的含量与分布，对其进行定位、定性及定量的研究。

图1 高温高压EDTA 修复表达Fig 1 Positive expression of high temperature and pressure EDTA retrieval

图2 微波EDTA 修复表达Fig 2 Positive expression of microwave EDTA retrieval

图3 高温高压柠檬酸钠修复表达Fig 3 Positive expression of high temperature and pressure citrate retrieval

图4 微波柠檬酸钠修复表达Fig 4 Positive expression of microwave citrate retrieval

Image-Pro Plus 7.0 是由美国Media Cybernetics 生产的全球顶级32 位图像处理与分析系统软件，目前应用于测量细胞的核浆比、免疫组织化学染色图片分析、DNA 分析、蛋白颗粒分析、相同细胞不同亚群分析等。以往对免疫组化图片的分析多采用阳性细胞百分比联合阳性细胞染色强度评分的方式，是半定量的分析方法，人为判定干扰因素较大且组内缺乏一定的关联性。后采用灰度值方式表达，虽然其具有量的概念，但灰度值受染色时间、显微镜照明光源的亮度影响，且与阳性表达呈负相关。光密度与切片阳性表达强弱呈正相关是通过计算同一标本最亮区域与待测目标的平均灰度值的比值，再通过一系列的数学公式计算得来，其不仅具有量的概念，而且大大减小了由于直接测量目标区域所产生的误差［9］。有研究显示，传统半定量描述+、++之间定量数与灰度值和光密度存在统计学差异，在这时阳性区域强弱定量分析更有意义［10］。

本实验不仅采取最先进的指标，在结果判定部分更加准确，将随机选择的5 个视野，应用日本尼康显微镜(放大400 倍)、CCD 图像传感器拍摄免疫组化图片，调整为灰阶8 位，避免背景着色的干扰，并进行标准化校正，对各组免疫组化实验结果进行标准光密度(standard optical density，SOD)测定及分析，每张至少取200 个单位染色区域面积，取其均值作为SOD 参数，计算5 个视野SOD 的平均值，平均标准光密度代表蛋白的颗粒密度，作为CK 染色区阳性反应的平均SOD 值。

不同的抗体在不同的修复条件下，表达强度不一。在实验中发现细胞广谱角蛋白CK 受抗原修复条件及修复液影响较大，根据患者入院时间进行编序随机盲法抽取11 例SNIP 患者病理切片，采用4种不同抗原修复方法及修复液。结果发现:高温高压EDTA 修复液修复后的CK 阳性表达强度明显优于其他3 种修复方法。

自1991年Shi SR 等［11］认为:使用抗原修复的抗体阳性检出率及阳性表达程度明显高于未修复者。微波、水浴pH 9.0 T ris -EDTA 热修复(水浴或微波)的切片，其表达效果优于pH 6.0 的柠檬酸盐缓冲液，阳性信号强，定位准确，背景清晰。修复液主要有:蒸馏水、柠檬酸钠缓冲液、EDTA。目前抗原修复一般采用:电炉、微波炉加热，高压锅加热及微波炉加热。不同的抗体，其最佳的抗原修复方法和抗原修复液不尽相同，可能与抗原暴露、修复的原理不同、各种抗体对各种修复液的敏感性不一致，并且与修复时间及温度密切相关。微波热修复是利用微波缓冲液的离子或极性分子高速运动的直接碰撞和高温条件使醛-氨基、抗原与其他分子间的交联或由蛋白质一级结构折叠成的三维结构因水解而断裂，暴露出被掩盖的抗原决定簇［12-13］。本实验旨在探讨不同修复条件及修复液对广谱细胞角蛋白CK 的阳性表达程度的影响，本实验通过利用先进的图像分析仪从数值上更加准确地证明:应用高温高压EDTA 修复液，可优化CK 抗原修复效果。

对于不同抗体，合理选择抗原修复方法是一个需要在实际操作过程中反复摸索而不断完善的过程，其主要目的是提高难以检测到的细胞内和细胞核内的抗原检测率和染色强度，为病理诊断提供准确性和稳定性的参考依据，为临床工作做出更好的指导作用。

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