乌司他丁对老年小鼠术后中枢炎症反应及学习记忆能力的影响

董浩林，李文瑶，庞久明，陶国才

(1.解放军第210 医院分院 麻醉科，辽宁 大连116031;2 第三军医大学 西南医院 麻醉科，重庆400038)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年人临床术后常见并发症，临床表现为以记忆下降为主的认知功能下降［1］。POCD 高发于老年人，中枢炎症反应被认为是术后认知功能障碍的重要发病机制之一。乌司他丁(Ulinastatin，UTI)是从人体尿液中提取的尿胰蛋白酶抑制剂，能抑制多种蛋白、糖和脂类水解酶的活性，减少炎性介质的过度释放，改善微循环和组织灌注。本课题观察了乌司他丁能否通过抑制中枢炎症反应改善老年小鼠术后认知功能。

1 材料和方法

1.1 材 料

实验动物选用17月龄老年雄性C57 小鼠，由重庆科迈公司提供。小鼠饲养于饲养室，饲养室湿度60%左右，温度23 ～25 ℃，光线良好，12 h 昼夜交替，小鼠随意进食，取水。

1.2 方 法

1.2.1 实验分组及模型制备:实验动物分为对照组(C 组)，手术组(S 组)，乌司他丁组(W 组)。每组30 只，12 只进行水迷宫测试，18 只于手术结束后1、3、7 天取海马进行PCR 实验，每次6 只。

S 组及W 组小鼠采用小鼠剖腹探查模型，5%水合氯醛(4 ～6 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，W 组使用乌司他丁腹腔注射(10 000 U/mL，100 U/g)。手术组使用生理盐水腹腔注射(0.5 mL)。10 min 后消毒腹部皮肤，取正中切口，长约3 cm，止血后依次探查腹腔器官，每10 min 探查1 次，每次约1 min。共探查3 次后依次缝合腹腔，皮下注射丁丙诺啡术后镇痛。手术共进行约40 min。对照组不进行手术。

1.2.2 Morris 水迷宫(Morris water maze)行为训练和测试［2］:Morris 水迷宫仪器为直径120 cm，高50 cm 的圆形水池，水色为不透明黑色，在水池边缘上等距离设东、西、南、北4 个标记点，将水池均等地分为4 个象限。水池水深30 cm，在第3 象限正中距池壁30 cm 放1 圆形透明站台，水面高出站台表面1.5 cm。水温控制在(22. 0 ±0. 5)℃。各组动物实验前1 天分别放入水中2 min 适应环境。实验在隔音的房间内进行，水池、光源、鼠笼、站台等实验室各物件的位置保持不变。(1)定位航行实验(place navigationtest):实验历时6 d，前3 天作为训练，后3 天作为测试成绩。每只小鼠每天训练4 次，每次从不同的象限采用随机的入水点，每次实验以60 s 为限，实验时将小鼠面朝池壁轻轻放入水中，同时计算机自动记录小鼠从入水点到达站台所需时间(潜伏期)作为学习和记忆成绩。小鼠找到并爬上站台后，让其停留30 s;若小鼠入水后60 s 内未能找到或爬上站台，则将其放置于站台上站立30 s(记录为60 s)。然后将小鼠从站台上取下休息至少30 min，再进行下一次训练。记录小鼠找到平台的时间，即逃逸潜伏期(Escapelatency)4 次平均值作为当天数据记录。(2)空间探索实验(Spatialprobetest):训练完毕次日进行空间探索实验，撤除平台，记录小鼠60 s 内穿过原平台位置的次数作为空间记忆成绩。

1.2.3 IL-1β，TNF-α mRNA RT-PCR 检测:分离海马，Trizol 法分别提取组织细胞总RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆转录试剂盒说明，反转录条件:42 ℃10 min，30 ℃20 min，99 ℃5 min，4 ℃5 min。以引物设计软件Primer Premier 5. 0 设计IL-1β，TNF-α 及内参β-actin 引物IL-1beta 上游基因序列:GCCCATCCTCTGTGACTC，下游基因序列:TGTGCCGTCTTTCATTAC. TNF -a 上游基因序列:GGAACTGGCAGAAGAGGC，下游基因序列:CACTTGGTGGTTTGCTACG。β - actin 上游基因序列:GCATTGTGGAAGGGCTCA ，下游基因序列:GGGTAGGAACACGGAAGG。取5 μL 样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。1 μL DNA 样本作为PCR 扩增模板，阴性对照扩增模板为去离子水;扩增条件为95 ℃预变性2 min;随后95 ℃10 s，退火温度15 s，72 ℃延伸45s，共40 个循环;最后72 ℃延伸10 min，使用加权计算结果进行相对灰度值对比。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0 统计软件进行数据分析处理。数据以均数± 标准差表示，采用单因素方差分析(one—wayANOVA)以及PostHocTests 多重比较检验(MultipleComparisons)LSD 法。

2 结 果

2.1 逃逸潜伏期结果

术后4 ～6 天，手术组(S 组)小鼠平均逃逸潜伏期相比对照组(C 组)3 天具明显上升，学习记忆功能下降(P ＜0.01)。乌司他丁组(W 组)平均逃逸潜伏期相比手术组明显下降，表明学习记忆功能改善(P ＜0.01)(表1)。同一天内，相同年龄组游泳速度无差异(表2)。

表1 逃逸潜伏期Tab 1 The escape latency ( ± s)

1)与对照组C 组比较，P ＜0.01;2)与手术组S 组比较，P ＜0.01

组别 第4 天 第5 天 第6天C 组29.60 ±2.2 23.00 ±2.7 20.20 ±2.6 S 组 46.03 ±5.31) 38.17 ±4.21) 30.38 ±3.21)W 组 30.84 ±4.11)2) 26.99 ±3.51)2) 24.60 ±2.71)2

表2 定位航行实验小鼠游泳速度Tab 2 The mice Place navigation test Swimming speed( ± s)

表2 定位航行实验小鼠游泳速度Tab 2 The mice Place navigation test Swimming speed( ± s)

组别 第4 天 第5 天 第6天C 组227 ±25.13 238 ±27.47 231 ±19.97 S 组 219 ±31.83 228 ±22.24 238 ±21.35 W 组238 ±30.95 227 ±26.22 234 ±24.78

2.2 空间探索实验

手术组(S 组)小鼠穿过原平台次数(1. 67 ±1.6)相比对照组(3.50 ±4.5)(C 组)明显减少，学习记忆功能下降(P ＜0.05)。乌司他丁组(W 组)穿过原平台次数(2.83 ±2.2)相比手术组明显上升，学习记忆功能改善(P ＜0.05)。相同年龄组游泳速度无差异。

2.3 海马炎症因子PCR 结果

手术后1 d，3 d，7 d 手术组(S 组)IL -1β，TNF-α 表达较对照组(C 组)明显上升(P ＜0.01)，术后1 d，3 d 乌司他丁组(W 组)相比手术组抑制了IL-1β 表达(P ＜0.01)。见表3，4。

表3 IL-1β 表达相对灰度值Tab 3 The relative grey value of IL-1β ( ± s)

表3 IL-1β 表达相对灰度值Tab 3 The relative grey value of IL-1β ( ± s)

1)与对照组比较，P ＜0.01;2)与手术组比较，P ＜0.01

组别 C 组 S 组 W组1 d 0.55 ±0.043 2.48 ±0.261) 1.61 ±0.291)2)3 d 0.55 ±0.043 2.23 ±0.211) 1.53 ±0.321)2)7 d 0.55 ±0.43 1.55 ±0.871) 1.38 ±0.341)

表4 TNF-α 表达相对灰度值Tab 4 The relative grey value of TNF-α ( ± s)

表4 TNF-α 表达相对灰度值Tab 4 The relative grey value of TNF-α ( ± s)

1)与对照组比较，P ＜0.01;2)与手术组比较，P ＜0.01

组别 C 组 S 组 W组1 d 0.52 ±0.051 2.19 ±0.291) 1.49 ±0.321)2)3 d 0.52 ±0.051 2.07 ±0.321) 1.46 ±0.271)2)7 d 0.52 ±0.051 1.51 ±0.211) 1.45 ±0.321)

3 讨 论

POCD 主要发生于老年人，发病率较高，发病机制不清。据国际术后认知功能障碍研究组织一项多中心，大样本研究发现60 岁以上的患者行非心脏大手术后1 周POCD 的发生率为25.8%，3 个月时为9.9%，且POCD 发病与术中低血压，低氧血症无关［1］。为了保护小鼠的运动功能，本实验术中未监测小鼠的血压，血氧。POCD 发病与手术类型相关，临床腹部手术是发病率较高的手术［3］，研究认为剖腹探查手术建立POCD 模型发病率较高［4］。本组前期实验也证实剖腹探查手术对循环影响较小，可成功地建立POCD 模型。

水迷宫是现今国际上常用的评估小鼠空间学习记忆的模型。实验程序包括:(1)定位航行实验(place navigation test，PNT)，用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆获取能力。潜伏期越短，说明学习记忆能力越好。(2)空间探索实验(spatial probe test，SPT):用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位忆的保持能力。相同时间内，通过原平台次数越多，说明学习记忆能力越好。本实验发现手术可使小鼠潜伏期延长，穿越原平台次数减少，说明手术可使小鼠学习记忆能力下降。使用乌司他丁后进行手术比单纯手术小鼠潜伏期缩短，穿越原平台次数增多，说明使用乌司他丁可改善手术引起的小鼠学习记忆能力下降。

中枢神经系统免疫异常是神经退行性疾病研究的焦点，应激、炎症、手术等都可激活中枢炎症反应。随着近年来对多种神经系统神经退行性病变(如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、多发性硬化)发病机制的研究表明，脑内慢性炎症反应可能是其重要病理特征之一，由此提出了此类疾病的炎症机制［5-8］。术后认知功能障碍的发病及老年易感性也被认为与中枢免疫反应异常造成的炎症反应密切相关［9］。

乌司他丁(Wlinastatin，UTI)是从人体尿液中提取的尿胰蛋白酶抑制剂，能抑制多种蛋白、糖和脂类水解酶的活性，减少炎性介质的过度释放，改善微循环和组织灌注。

乌司他丁的中枢保护作用已有研究证实［10］。神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase，NSE)是神经元损伤的敏感性指标，具有高度特异性。黄唯佳等［10］发现乌司他丁可以降低心肺复苏后小鼠NSE 含量。陈小莉等［11］发现乌司他丁在一定程度上减轻CPB 后认知功能损伤，有一定的脑保护作用。但乌司他丁脑保护的机制尚不清楚。研究发现乌司他丁能抑制氧自由基的产生，阻抑内源性休克因子如心肌顿抑因子(myocardial depressantfactor，MDF)生成，抑制多种炎症介质如肿瘤坏死因子(TNF-α )、血小板活化因子(PAF)、白介素(IL -6，IL-8)等产生［12-15］。本实验也发现使用乌司他丁可减少手术引起的中枢炎症反应，可能与改善手术引起的小鼠学习记忆能力下降相关。

综上，乌司他丁可能通过减少手术引起的中枢炎症反应，起到改善手术引起的学习记忆下降的作用。乌司他丁可能对POCD 的防治具有一定作用，需要进一步研究。

［1］ Moiler JT，Cluitmans P，Rasmussen LS，et al. Long—term postoperative cognitive dysfunction in the elderly ISPOCD1 study［J］.Lancet，1998，351:857 -861.

［2］ Nunez J. Morris water maze experiment［J］. J Vis Exp，2008，24(19):897.

［3］ Johnson T，Monk T，Rasmussen LS，et al. Postoperative cognitive dysfunction in middle -aged patients［J］. Anesthesiology，2002，96:1351 -1357.

［4］ Takata K，Kitamura Y，Taniguchi T，et al. Pathological changes induced by amyloid - beta in alzheimer＇s disease［J］.J Pharmaceut Soc Jpn，2011，31(1):3 -11.

［5］ Lee YJ，Han SB，Nam SY，et al.Inflammation and alzheimer＇s disease［J］. Arch Pharm Res，2010，33(10):1539 -1556.

［6］ Shan S，Hong -Min T，Yi F，et al. NEW evidences for fractalkine/CX3CL1 involved in substantianigral microglial activation and behavioral changes in a rat model of Parkinson＇s disease ［J］. Neurobiol Aging，2011，32(3):443 -458.

［7］ Ros - Bernal F，Hunot S，Herrero MT，et al. Microglial glucocorticoid receptors play a pivotal role in regulating dopaminergic neurodegeneration in parkinsonism［J］. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of America，2011，108(16):6632 -6637.

［8］ Hu ZH，Ou YW，Duan KM，et al.Inflammation:A bridge between postoperative cognitivedysfunctionandAlzheimer ＇sdisease［J］.Medicalhypotheses，2010，74(4):722 -724.

［9］ Shu Y，Yang Y，Qiu W，et al.Neuroprotection by ulinastatin in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Neurochem Res，2011，36(11):1969 -1977.

［10］ 黄唯佳，陈寿权，周世方，等.乌司他丁对心肺复苏后大鼠血清神经元特异性烯醇化酶的影响及作用［J］.温州医学院学报，2009，39(2):126 -128.

［11］ 陈小莉，张宜林，刘利娜.乌司他丁对心肺转流心内直视术患者认知功能的影响［J］. 中国实用神经疾病杂志，2009，12(10):9 -11.

［12］ Nishise S，Takeda Y，Fujishima S，et al.Release of interleukin - 1 receptor antagonist by combining a leukocyte adsorption carrier with ulinastatin［J］. Ther Apheresis dialysis，2010，14(4):386 -391.

［13］ Bao PT，Gao W，Li SJ，et al.Effect of pretreatment with high - dose ulinastatin in preventing radiation - induced pulmonary injury in rats［J］. Eur J Pharmacol，2009，603(1 -3):114 -119.

［14］ Xu L，Ren B，Li M，et al.Ulinastatin suppresses systemic inflammatory response following lung ischemia - reperfusion injury in rats［J］. Transplant Proceedings，2008，40(5):1310 -1311.

［15］ Jian-Bo Y，Shang -Long Y. Protective effects of hemin pretreatment combined with ulinastatin on septic shock in rats［J］. Chin Med J，2008，121(1):49 -55.