安体舒通对糖尿病大鼠肾脏Nephrin 蛋白表达的影响

丁洪成，刘艳红，廖春分

(1.湖北医药学院 附属十堰市人民医院 内分泌科，湖北 十堰442000;2.湖北医药学院 附属十堰市人民医院 药剂科，湖北 十堰442000)

微量蛋白尿是糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)早期的表现之一，也是促进DN 进展的重要因素。近年来研究发现，Nephrin 分子主要在肾小球足细胞中表达，且定位于裂孔膜，对裂孔膜的完整性起着关键作用。Nephrin 蛋白表达的缺乏可导致大量蛋白尿及肾功能衰竭［1-2］。安体舒通是一种非选择性醛固酮受体拮抗剂，大量研究发现安体舒通对肾脏有很好的保护，通过抗炎、抗氧化应激等作用延缓糖尿病肾病进展［3］，但其对蛋白尿的作用及其作用机制尚未完全阐明。本文旨在通过观察安体舒通对Nephrin在DN 大鼠肾小球足细胞中表达的影响，探讨安体舒通对糖尿病肾病肾脏的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物:成年雄性SD 大鼠30 只，体重200 ～250 g，由湖北医药学院动物中心提供，动物许可证号:SCXK(鄂)2011 -0008。

试剂及仪器:链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，美国Sigma 公司;兔抗人nephrin 多克隆抗体，鼠β-action 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司。

1.2 实验方法

分组及模型的制备:建立糖尿病大鼠模型，大鼠随机选取6 只为正常对照组(NC 组)，其余24 只为实验组。实验组禁食12 h 后给予单次腹腔STZ 60 mg/kg，72 h 后尾静脉采血，血糖仪测定随机血糖＞16.7 mmol/L 者认为模型成功，血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠舍弃，对照组仅予注射等量枸橼酸缓冲液。8 周后测定BS、UAER，随机BS ＞16.7 mmol/L、UAER ＞30 mg/kg·d 确定糖尿病肾病模型成立［4］。

给药方法:正常对照组给予生理盐水灌胃，糖尿病肾病模型成功后随机分为DN 组和安体舒通组，每组12 只。安体舒通组给予安体舒通(20 mg/kg，灌胃)1 次/d。对照组和DN 组每天等量生理盐水灌胃，1 次/d。实验12 周末，留取标本，处死大鼠。

尿素氮和尿肌酐及尿蛋白的测定:处死大鼠前收集24 h 尿液标本，24 h 尿蛋白测定采用比浊法。Scr、BUN、脂蛋白A 采用自动生化分析仪检测。

Western Blot 检测Nephrin 蛋白:取100 mg 肾组织置入0.5 mL RIPA 裂解液中匀浆，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用BCA 法测蛋白蛋含量。经8%SDS-PAGE 电泳，电转至PVDF 膜上，采用5%脱脂奶粉-TBST 溶液封闭1 h，加入兔抗大鼠Nephrin 一抗4 ℃过夜，洗膜，再用HRP 羊抗兔多克隆二抗杂交，室温，1h。采用ECL 显色。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠一般情况

NC 组大鼠饮食、饮水、尿量、体重都正常，而DN 组出现典型糖尿病症状，多饮，多尿，多食，体重减轻，毛色无光泽。经安体舒通干预后，糖尿病大鼠三多一少症状有所改善。安体舒通组与DN 组大鼠相比，血糖有所下降，但差异无显著性意义。

2.2 24h 尿蛋白(24hUpro)、血尿素氮(BUN)、肌酐清除率(Ccr)、血脂蛋白A(ApoA)的变化

12 周末，模型组与正常对照组比较，24 h 尿蛋白、肌酐清除率、血尿素氮和血脂蛋白均显著性升高(P ＜0.05)。经安体舒通治疗12 周后，安体舒通组与DN 组比较，24h 尿蛋白、血肌酐和血脂蛋白均下降(P ＜0.01)，血尿素氮虽有下降，但差异无显著性意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血尿素氮和血肌酐、24 h 尿蛋白定量和脂蛋白比较Tab 1 Comparison among groups of BUN、Ccr、24hUpro and ApoA ( ± s)

表1 各组大鼠血尿素氮和血肌酐、24 h 尿蛋白定量和脂蛋白比较Tab 1 Comparison among groups of BUN、Ccr、24hUpro and ApoA ( ± s)

1)与NC 组比较，P ＜0.05;2)与DN 组比较，P ＜0.01

组别 BUN(mmol/L) Ccr(μmol/L) 24hUpro(mg/24h)ApoA NC 组(n=6)5.6 ±1.7 41.0 ±5.2 59 ±16 19.1 ±4.8 DN 组(n=12) 10.7 ±2.11) 94.3 ±10.21) 448 ±1021) 150.3 ±22.71)安体舒通组(n=12) 9.9 ±2.3 79.4 ±8.92) 274 ±992) 104.1 ±17.32)

2.3 肾组织Nephrin 蛋白水平的变化

如图1所示，Western Blot 条带光密度分析显示DN 组与NC 组比较，Nephrin 蛋白水平表达下降(P ＜0.01)，而采用安体舒通干预后，Nephrin 蛋白表达较DN 组升高(P ＜0.05)。Nephrin 分子量为185 kD，内参β-action 条带分子量为42 kD。

3 讨 论

糖尿糖肾病是糖尿病最常见的并发症之一，以微血管病变为主，早期以微量白蛋白尿为主要症状，24 h 尿蛋白定量是诊断早期糖尿病肾病的敏感指标。尿蛋白的发生主要取决于肾小球滤过膜的功能，滤过膜结构和电荷屏障受损，直接促进了糖尿病肾病的病程进展［5］。本研究结果显示糖尿病DN 组血肌酐、尿素氮和24 h 尿蛋白均升高，这说明糖尿病肾病模型成功建立，同时糖尿病肾病的大鼠肾组织Nephrin 蛋白水平升高，这与以往的报道一致。

图1 各组Nephrin 蛋白水平的比较Fig 1 Western Blot analysis of Nephrin expression among three groups

足细胞是肾小球主要滤过屏障之一，其结构和功能的完整性直接影响到尿蛋白的生成。Nephrin是相邻足细胞间裂孔隔膜的主要特异性蛋白之一，通过细胞信号转导介导足细胞肌动蛋白骨架的重新排列，从而改变足细胞的形态与功能［6］。研究发现糖尿病肾病的小鼠，肾小球nephrin mRNA 表达在8周、16 周、24 周均表达降低［7］。已有研究显示糖尿病肾病模型肾组织足细胞及其蛋白标志物nephrin 、podocin 表达水平，且与24 h 尿蛋白呈负相关［8］。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)与糖尿病肾病的发生与发展密切相关，在糖尿病状态下，肾素血管紧张素系统被激活，肾脏组织局部醛固酮分泌增加，通过盐皮质激素受体发挥调节水盐代谢。越来越多研究显示，醛固酮作为RAAS 下游重要活性分子，在参与足细胞损伤、尿蛋白的生成起着重要作用。足细胞本身可表达具有功能活性的RAAS 系统受体，如血管紧张素II 受体，盐皮质受体等，足细胞的增殖、凋亡、细胞骨架被证实亦受RAAS 受体系统调控［9］。随着“醛固酮逃逸”现象的发现，以醛固酮为靶点的治疗显得重要。Shibata 等［10］采用醛固酮灌注大鼠4 周，发现其肾小球足细胞足突增宽、节段性融合、足细胞凋亡增加其标志，其标志蛋白nephrin、podocin 表达明显下降。Mehdi 的一项临床试验中，观察分别接受安体舒通、氯沙坦及安慰剂治疗的糖尿病患者48 周，发现相对于安慰剂，安体舒通组患者尿蛋白下降34%，缬沙坦组该数据为16.8%，提示醛固酮可独立引起糖尿病肾脏损伤［11］。故阻断醛固酮的生物效应可使糖尿病肾脏得到有益的保护作用。安体舒通为酫固酮拮抗剂，研究发现其可通过降低心脏负荷，改善心脏的舒张功能，改善糖尿病患者的内皮功能，而对糖尿病肾组织有保护作用，但对肾小球足细胞Nephrin 的作用还不清楚。

本研究显示相对于正常大鼠，糖尿病肾病鼠BUN、Ccr、24hUpro 明显升高，Nephrin 表达下降，差异有显著性意义。安体舒通干预组肾功能较DN 组好转，且Nephrin 表达升高，说明其可显著改善糖尿病大鼠的肾功能。与DN 组相比，血脂蛋白A 下降而肾组织nephrin 蛋白表达水平升高。以上提示安体舒通对肾脏的保护作用可能通过上调Nephrin 蛋白保护足细胞而实现的。血脂蛋白A 是冠心病独立的危险因子，免疫组化技术研究发现血脂蛋白A特异性存在于动脉粥样斑块中，参与动脉粥样硬化的形成。结果显示，安体舒通可以降低肾小球动脉血管的硬化，这可能也与其保护肾脏组织有关。

Nephrin 蛋白的表达可受到多种因素的影响，血管紧张素或肾脏炎症信号因子NF -kB 等［12］，而研究表明安体舒通可阻断醛固酮的作用，可降低其对MAPK 信号通路的激活，阻止肾小球的肥大与纤维化;抗氧化应激，减少ROS 的产生，减少NFkB 等炎症因子的产生，所以安体舒通可能也是通此途径上调Nephrin 蛋白的表达，同时减少肾小球血管硬化，而对糖尿病的肾脏组织有保护作用。

综上所述，安体舒通在糖尿病肾病早期起积极干预作用，可能和其抗醛固酮、抗氧化应激、降血脂蛋白、促进肾脏Nephrin 蛋白表达有关。而Nephrin蛋白上调进一步改善足细胞的结构，从而降低肾小球对白蛋白的滤过，降低了蛋白尿水平，减轻肾脏组织损伤，从而改善了肾功能。

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