抗菌肽KS26基因的串联及在毕赤酵母中的表达

张元新，葛雅琨

(吉林化工学院化工与生物技术学院，吉林吉林132022)

自青霉素诞生以来，抗生素一直是治疗人类病原微生物感染疾病的重要武器;但是，随着抗生素的滥用及致病菌的多药耐药性的产生，抗生素逐渐失去往日的作用效果，所以寻找新型的抗菌资源已成为备受关注的焦点［1］.阳离子抗菌肽是由12-50个氨基酸组成的阳离子型的两亲性分子.目前，已作为一种新型抗生素被广泛研究，它们存在于动物、植物、微生物中，是细菌、植物、低等动物的主要防御机制［2］.在脊椎动物中，也能够运用特殊的免疫方式，作为一线防御物质，在病原微生物侵入早期抑制其生长［3］.因此，阳离子抗菌肽因其具有的阳离子电荷和两亲构象使其具有良好的抗菌活性，备受科研工作者的重视［4］.

利用固相态化学合成小片段阳离子小分子多肽成本太高［5］.因此，利用毕赤酵母系统进行体外重组表达的方法能够有效降低成本［6］.该系统具有很多优点［7］:(1)利用受甲醇诱导的醇氧化酶(alcohol oxidaseⅠ，AOX1)启动子，可严格控制外源基因的表达;(2)毕赤酵母生长快速，培养简单，适合高密度培养，发酵后每升培养液细胞湿重可达450克，有利于提高目的蛋白产量;(3)毕赤酵母作为一种真核细胞生物，可以进行蛋白翻译后的加工，以使外源蛋白蛋白得到正确的折叠盒修饰;(4)该系统已有20多年的研究开发历史，有多重受体菌和表达载体可供选择，可以进行胞内表达和分泌表达.因此，利用毕赤酵母真核表达系统进行小肽的重组表达，将有效降低生产成本，保证小肽的正确构象，提升其活性.本研究利用SOE-PCR方法快速、高效的获得了小分子多肽全基因，利用同尾酶得到基因串联体，并将其构建到毕赤酵母表在载体pPICZα A上，成功诱导出小肽的蛋白产物，为小分子多肽的真核表达研究奠定实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌种

pPICZα A 真核表达质粒、DH5α、GS115感受态细胞为吉林化工学院生物技术研究室保存.

1.1.2 主要试剂与仪器

质粒小量提取试剂盒(BioTeke)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(BioTeke)，限制性内切酶XhoI、XbaI、SalI、SacⅠ(Takara)，低分子量蛋白 Marker(BioTeke)，T4 DNA 连接酶(Takara)，Taq DNA polymerase(Fermentas)，Zeocin(Invivogen)，Tricine(Sigma).PCR 仪(Bio-Rad)，电子分析天平(Sartorius)，电泳仪和电泳转移槽(北京市六一仪器厂)，紫外可见透射反射仪(上海精科实业有限公司)，电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，凝胶成像系统(Bio-Rad).

1.2 方法

1.2.1 KS26 基因的设计

以毕赤酵母(Pichia pastoris)的偏爱密码子、多肽氨基酸序列为基础，设计基因全长78 bp.SOE-PCR的引物均用Primer 5辅助设计，克隆引物加入酶切位点XhoI、XbaI，在上下游引物的3，末端设计互补重叠序列，在反应体系中使两引物互为模板进行PCR.

1.2.2 KS26 全基因的获取

通过SOE-PCR的方法获取KS26全基因(78 bp).PCR程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30 个循环后72℃ 10 min结束反应.

反应体系:10 × PCR buffer 5 μl、MgCl23 μl、dNTP 1 μl、引物 F 1 μl、引物 R 1 μl、Taq1 μl、加ddH2O 至总体积 50 μl.

1.2.3 KS26 基因的串联

以KS26基因为基础，Primer 5辅助设计，分别在上游引物和下游引物加上同尾酶 Xho I、Sal I，引物见表1.酶切连接反应的缓冲液为:Tris-HCl(Ph 7.6)660 mmol/L、MgCl266 mmol/L、ATP 1 mmol/L、DTT 100 mmol/L、NaCl 1 mol/L.反应体系:10 × buffer 2 μl，新鲜的 PCR 产物 12 μl，Xho I 2 μl，Sal I 2 μl，T4 DNA Ligase 2 μl，总体积为20 μl.酶切连接反应条件:37℃酶切1 h;22℃连接1 h，10个循环后结束反应.

表1 KS26基因串联引物*

1.2.4 重组载体 PICZα-KS26的构建

KS26基因的PCR产物和载体pPICZα A均用XhoI、XbaI双酶切，将胶回收后的双联体KS26 PCR产物与载体pPICZα A在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜.连接产物转化感受态E.coli DH5α，转化平板(含 zeocin)37 ℃过夜培养.挑取单一菌落于10 μl无菌水中充分悬浮菌体，100℃裂解5 min，取1 μl作为模板进行 PCR验证.将验证阳性的单克隆接种于10～15 mL LB培养基(zeocin，终浓度为 100 μg/mL)，37 ℃，200 rpm培养过夜，质粒小提后，进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒交由上海生工生物工程有限公司测序部进行DNA测序.

1.2.5 pPICZα-KS26 转化 P.pastoris GS115(hismut+)转化子的筛选和鉴定

感受态 P.pastoris GS115(his-mut+)(80 μL)与 SacⅠ线性化的 pPICZα-小分子多肽(5 μg)混合，转移至预冷的 0.2 cm电转杯中，置冰上5 min，1.5 kV、25 μF、200 Ω 电击 5 ms，立即加入1 mL预冷的1 mol/l山梨醇，取出200 μL涂布于MD板上，30℃培养2 d，通过比较转化子在MM和MD板上的生长速度来筛选Mut+转化子.

采用PCR方法分析P.pastoris转化子，挑取平板上的菌体，加入5 μL无菌水中，煮沸5 min，加入重新设计的鉴定引物F-tcgactcgagatgaagaaggtttcc和 R-ctgacttctagagtcgactccattg，反应体系同上，进行PCR反应.

1.2.6 重组子 PICZα-KS26 在 P.pastoris菌在摇瓶中的诱导表达

挑取重组 P.pastoris，接种到 BMGY中，30℃、230 rpm/min振荡培养约20 h至OD600达到2～6;室温3000 rmp/min离心5 min，用BMMY(含1%Casaminoacids)重悬至 OD600约为1.0，30℃、250 rpm/min震荡培养，进行甲醇诱导表达，每隔24 hr取样，同时补加100%甲醇至终浓度为0.5%.

1.2.7 Tricine-SDS-PAGE

取5 μl表达上清液进行 Tricine-SDS-PAGE，凝胶采用硝酸银染色，实验步骤参照Hermann的方法.

2 结 果

2.1 KS26全基因的获取及串联体的构建

为了能使KS26在毕赤酵母系统中高效表达，我们按照毕赤酵母基因翻译的偏爱密码子设计合成F、R两条互补引物，并使两引物3’段的11个碱基互补，见表2.根据重叠PCR的原理，获取了78 bp大小的PCR产物，见图1A.

表2 KS26的氨基酸、基因和引物序列*

根据KS26全基因序列，我们重新设计了具有同尾酶Xho I、Sal I的上游和下游引物，并以SOE-PCR产物为模板，通过在PCR中重复完成酶切-连接的程序，成功获得了具有Xho I、Sal I酶切位点的二联体、三联体产物，见图1B.

图1 SOE-PCR方法获取的KS26全基因及其串联体

2.2 重组载体pPICZα-KS26的构建

将KS26基因进行胶回收，其产物和载体pPICZα 均用 XhoI、XbaI双酶切，用 T4 DNA Ligase连接，转化感受态 E.coli DH5α菌，筛选阳性克隆.重组质粒经双酶切鉴定并进行DNA测序，结果表明目的基因正确插入，DNA自动测序仪测序，序列如下:AAGAAGGTTTCCTTCAAGGTTAAGTTCAAGTCCGCTTGGGCTAAGACTGTTCATA CTGCTAAGCTGGCTCCTATTTCC.

2.3 筛选、鉴定Mut+转化子

为了获得更高的转化效率和高拷贝，采用电转化法将SacⅠ线性化的重组表达质粒pPICZα-KS26 转化P.pastoris GS115(his-mut+)，通过MM和MD板鉴定表型，大约80%的为Mut+;PCR扩增结果显示，阳性重组子出现了100 bp左右的插入目的片段，与预期相符，见图2.

图2 重组子的转化及PCR鉴定结果(DNA标准同图1)

2.4 Tricine-SDS-PAGE

抗菌肽KS26的分子量只有2.9 kD，在常规SDS-PAGE系统中难以得到理想的分辨率，我们使用Tricine-SDS-PAGE(16%分离胶，10% 浓缩胶，4% 浓缩胶，使重组小分子多肽得到较好的分离.Tricine-SDS-PAGE结果显示:甲醇诱导表达上清在2.9 kD处出现一条带，见图3.

图3 重组蛋白pPICZα-KS26的Tricine-SDS-PAGE电泳图

3 结 论

抗菌肽不仅具有杀菌还具有抗病毒和抗肿瘤细胞而不破坏人体正常细胞的作用，因此在农业、畜牧业、医药及食品工业中显示出越来越多的应用前景.阳离子抗菌肽水溶性好，且等电点在8.9～10.7之间，具有较强的阳离子特征，同时具有两亲α-螺旋和折β-叠片结构.阳离子抗菌肽具有广谱的抗菌活性，来自昆虫、猪、蛙、人的阳离子抗菌肽既有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的作用，又有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的作用［7-9］.通常研制和应用的抗菌肽均是从昆虫体液等天然物质中提取，来源途径广泛，但含量极低，提取步骤繁杂，很难获得大量高纯度的抗菌肽.目前阳离子抗菌肽的合成方法有化学合成和基因表达两种.化学合成得到的样品数量有限，而且差错率和副反应随着氨基酸数量的增多而增大，一般超过50个氨基酸的小肽很难合成.但阳离子抗菌肽结构简单、氨基酸残疾未被修饰，基因工程表达法是大量生产抗菌肽的理想方法［10］.本研究利用 SOE-PCR获取抗菌肽KS26的全基因及其串联体并构建了真核毕赤酵母表达系统，成功构建到进行了诱导表达，为快速、高效的进行小肽重组表达载体的构建、表达进行了有益的探索，有效地解决了小片段氨基酸合成成本过高的问题，将为短肽的规模化生产提供有效的实验依据.

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