小鼠外周血白细胞节律相关基因cry2，per2，timeless，rev-erb表达的近日节律性研究

李科华，王庆敏，刘秋红，戴圣龙，时粉周，姚永杰

生物的生理机能、生化代谢、行为表现等常以24 h为周期发生规律性变动，这种变动的节律称为近日节律。睡眠与觉醒、饥饿与口渴、血压、心脏收缩次数、体温、激素水平、免疫系统的功能等都随着白天和黑夜的交替而发生着变化，呈现出固有的近日节律现象［1］，而这一现象依赖于位于下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nucleaus，SCN)的中枢振荡器(central oscillators)和位于其他组织的外周振荡器(peripheral oscillators)共同维持［2］。这些节律振荡器的分子基础是相关节律基因的表达，因此，正确理解生物体各种近日节律的特点，关键环节之一是要明确其节律基因的昼夜表达特点。

机体的免疫组分及免疫功能存在明显的近日节律。外周血中的白细胞在维持机体免疫功能、抵抗微生物感染过程中起着重要的作用。笔者先前的研究表明［3］，小鼠外周血白细胞存在明显的近日节律性，但其近日节律性是如何被基因调控的，目前尚不太清楚，本研究利用实时定量PCR技术测定12L/12D光制条件下，白细胞中主要节律基因cry2，per2，timeless，rev-erb的昼夜表达特点。本研究不仅将为深入理解免疫系统功能的调控机制提供依据，也将为深入理解特殊岗位人员(如航天员、长航舰员及跨时区飞行的飞行员及乘员、护士等)由于工作岗位的需要导致的免疫功能近日节律紊乱提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性C57/BL6小鼠48只，体质量16～20 g，4～6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 实验试剂

焦碳酸二乙酯(DEPC)、Trizol、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒均购自Takara公司，红细胞裂解液购自BD公司，其他生化试剂均为国产分析纯，购自上海生工生物有限公司。

1.3 试验方法

(1)动物模型的建立:采用完全随机分组方法将48只小鼠分为6组，分别对应6个时间点，每组8只。将其置于稳定的人工照明环境中喂养，室温(20±2)℃，光照强度为250～300 Lx。光暗循环周期为12 L(光照条件)/12 D(黑暗条件)，其中光照时间为8:00-20:00，黑暗时间为20:00-8:00，小鼠自由摄食、饮水。光照4周后，6组小鼠分别在9:00、13:00、17:00、21:00、1:00、5:00 6个时间点，用毛细玻璃管经框后静脉取血;黑暗期操作时红光强度为10～15 Lx。

(2)节律基因引物设计:引物的设计采用生物信息学软件在线辅助完成。引物合成由上海生工生物有限公司完成。利用18s作为内参，对各节律基因的丰度进行校正。各基因引物分别如下:

cry2:forward primer 5'-TCG GCT CAA CAT TGA ACG AA-3'，reverse primer 5'-GGG CCA CTG GAT AGT GCT CT-3';

per2:forward primer 5'-GGC TTC ACC ATG CCT GTT GT-3'，reverse primer 5'-GGA GTT ATT TCG GAG GCA AGT GT-3';

rev-erb alpha:forward primer 5'-CGT TCG CAT CAA TCG CAA CC-3'，reverse primer 5'-GAT GTG GAG TAG GTG AGGTC-3';

timeless:forward primer 5'-CGA CGA AGA GGA AGA TGA TGAGG-3'，reverse primer 5'-TCC AAC TCA CAT CGG TCA AAC A-3';

18s:forward primer 5'-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3'，reverse primer 5'-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3';

(3)总RNA提取:外周血经Na2EDTA抗凝处理(1∶1)后，再破红处理;随后按Trizol试剂说明书进行RNA抽提。提取的RNA用紫外分光光度计，在波长260 nm和280 nm下测定光密度值(optical density，OD)，并计算OD260/OD280的比值。比值大于1.7的样品，用于后续的反转录实验。

(4)反转录和实时定量PCR:每个样品取500 ng样品RNA，进行反转录。反应实验歩骤严格按照试剂盒说明书进行。反应条件为37℃ 15 min，85℃5 s。所得 cDNA分别利用特异引物进行实时定量PCR扩增，反应条件参照试剂盒说明书进行，利用18 s对各时钟基因的丰度进行校正。实时定量PCR试剂为Takara SYBR Premix-ExTaqⅡ(DRR820A)。采用仪器为Corvett RotorGene 60000。

1.4 统计学处理

实验中将第一个时间点9:00的值作为1，其他各点均为相对于9:00时的值，计算2-Δct值。数据采用均数±标准差±s)表示，组间差异采用Student's t检验比较。用Matlab分析软件获取节律相关参数，并经振幅F检验确定是否存在近日节律性。用于拟合的方程为:F(t)=M+Acos(ωt+φ)，其中，M为中值，即涨落变化的中线，A为节律震荡的振幅，ω为上下波动的幅度，φ为峰值相位，t是振荡达到峰值的时刻。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cry2基因mRNA的昼夜表达特点

从图1可以看出，24 h内，外周血白细胞基因cry2 mRNA呈现明显的近日节律性振荡变化。峰值和谷值的 mRNA水平分别为2.196±0.193和0.509±0.037，峰值为谷值的4.3倍左右，差异有统计学意义(P＜0.01)。经余弦函数软件分析，得到最佳的拟合余弦曲线为y=0.865 6+0.687 8×cos(15°/h×t+180°)，M=0.865 6，A=-0.687 8，峰值相位时间约为12:00。

图1 LD光制条件下cry2基因mRNA水平昼夜节律性表达

2.2 per2基因mRNA的昼夜表达特点

从图2可以看出，per2 mRNA昼夜水平变化很大，呈明显的近日节律性。per2峰值和谷值的mRNA水平分别为4.000±0.381和0.321±0.027，峰值为谷值的12.5倍左右，差异有统计学意义(P＜0.01)。经余弦函数软件分析，得到最佳的拟合余弦曲线为 y=2.042+0.206 4×cos(15°/h×t-67.04°)，M=2.042，A=0.206 4。峰值相位时间约为4∶28。

图2 LD光制下per2基因mRNA水平昼夜节律性表达

2.3 timeless基因mRNA的昼夜表达特点

如图3所示，timeless mRNA呈明显的近日节律性。timeless峰值和谷值的mRNA水平分别为3.074±0.221和0.449±0.021，峰值为谷值6.8倍左右，差异有统计学意义(P＜0.01)。timeless基因不同昼夜时间点的表达相对值，经余弦函数软件分析，得到最佳的拟合余弦曲线为 y=1.24+0.807 6×cos(15°/h×t-172.74°)，M=1.24，A=0.807 6。峰值相位时间约为11∶30。

图3 LD光制下timeless基因mRNA水平昼夜节律性表达

2.4 rev-erb基因mRNA的昼夜表达特点

如图4所示，rev-erb基因mRNA呈明显的近日节律性。rev-erb基因的mRNA峰值和谷值分别为3.605±0.212和0.761±0.080，峰值为谷值4.7倍左右，差异有统计学意义(P＜0.01)。rev-erb基因不同昼夜时间点的表达相对值，经余弦函数软件分析，得到最佳的拟合余弦曲线为y=1.603+0.542 6×cos(15°/h×t-166.88°)，M=1.603，A=0.542 6。峰值相位时间约为11∶07。

图4 LD光制下rev-erb基因mRNA水平昼夜节律性表达

3 讨论

相关研究表明，哺乳动物的免疫系统(包括细胞免疫和体液免疫)在24 h内数量和功能均存在近日节律性［4］。免疫功能近日节律的紊乱也会导致疾病的发生［5］。研究表明，长期夜班的女性患乳腺癌的机率明显高于正常上班人群，而夜班的男性人群易患前列腺癌［6］。早期的研究显示，体温波动规律的癌症患者其预后明显好于体温不规律的患者。临床研究显示，休息活动时间错乱的转移癌患者其生存时间明显缩短［7］。目前免疫系统近日节律失调与肿瘤的发生有关已经得到证实。在肝癌大鼠中发现，不但其免疫系统在构成上发生变化，其原有的近日节律也遭到破坏。在HIV感染的患者中，T、B淋巴细胞的近日节律性逐渐丧失。导致免疫功能近日节律紊乱的根源可能在于相关近日节律基因的表达异常。正确理解免疫功能近日节律的前提是要明晰正常状态下免疫组织、器官的节律调控基因的表达特点。相关研究表明，节律相关基因确实参与了哺乳动物免疫功能的调控［8］。

哺乳动物外周血中有大量的免疫细胞，在哺乳动物免疫功能中起着重要的作用。笔者先前的研究表明，在小鼠循环血液中，白细胞总数及其分类百分比在一昼夜时间里，存在明显的近日节律。本研究中，利用实时定量PCR技术对外周血白细胞中的节律相关基因的表达特性进行了研究。由于节律基因的表达有周期性变化的特点，因此本研究中考虑了时间的因素，在一昼夜中每隔4 h检测1次。

相关研究直接或间接证明，4种节律基因cry2、per2、timeless及rev-erb均在哺乳动物近日节律反馈环中发挥负反馈调节因子作用，但它们在外周血白细胞中是否存在近日节律性目前尚未明确。小鼠cry基因分布在多个组织，mcry2基因在中枢和外周视网膜高度表达，该基因敲除后，可使节律周期延长1 h，这说明它在哺乳动物昼夜节律的调节中发挥光导作用。mper2参与哺乳动物近日节律负反馈的调节。timeless在鼠SCN中高表达，但节律性很弱或无节律，而在视网膜高表达。体外实验证实，Tim蛋白可以抑制clock:bmɑl1介导的转录［9］。rev-erb通过抑制正向调节因子bmɑl1的转录而发挥负向调节作用。本研究结果表明，C57/BL6小鼠外周血白细胞中per2、cry2、timeless、rev-erb基因mRNA峰值与谷值差异明显(P＜0.01)，存在着明显的近日节律性。从峰值时间和震荡幅度看，cry2、timeless、rev-erb峰值时间比per2超前，振幅也比per2高(P＜0.01)，因此cry2、timeless、rev-erb负反馈的作用强于per2，而cry2、timeless、rev-erb的峰值时间、振幅大小比较接近，所以3者在外周血白细胞近日节律调节中的负反馈作用比较相近。

目前，SCN中的近日节律的调控机制已经基本明确，即clock:bmɑl1在哺乳动物中枢震荡器中以异二聚体形式结合，充当正向调节因子;而per和cry充当负调节因子。周围组织的近日节律调控机制不尽相同。相关研究［10］表明，肝、肾及脾脏中的近日节律调控存在明显差异，在肾和脾中，cry1和cry2在负反馈中占主要作用，而肝脏中per1在负反馈中占主要作用。本研究发现的外周血白细胞近日节律的调控机制与肝、肾、脾的节律调控机制有所不同。

本研究结果明确了小鼠外周血白细胞中的4种主要节律基因cry2、per2、timeless、rev-erb存在明显的近日节律性，这提示，它们可能参与了光诱导下外周血白细胞近日节律的调节。但它们如何参与外周血相关免疫细胞的调控，及在各种免疫细胞中所起的作用尚需进一步研究。本研究不但为深入认识免疫功能近日节律紊乱相关疾病的发病机制、病理生理过程，而且为指导疾病的早期诊断提供了依据，具有重要的理论意义和应用价值。

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(本文编辑:彭润松)