半夏总生物碱对人胃癌细胞增殖的抑制作用

陈雅琳，唐 瑛，王庆敏，孙 欢，周 茜

半夏系天南星科植物半夏属(Pinelliɑ Ternɑte(Thunb)Breit)的干燥块茎，是一种常见中药，首载于《神农本草经》，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效。笔者在前期的研究中发现，半夏总 生 物 碱(total alkaloids from Pinelliɑ Ternɑte，TATP)作为半夏的主要有效成分之一，具有抗多种恶性肿瘤的作用，如肝癌、乳腺癌、肺癌等［1-3］。然而，尚未见有关TATP对胃癌的抑制作用的报道，本实验旨在初步探讨TATP对人胃癌细胞株SGC-7901增殖的抑制作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)药品:TATP购自武汉银河化工有限公司，纯度87%，批号:20110321。用重蒸水配制储备液10 g/L，4℃保存备用。实验时，用培养基稀释至所需浓度。(2)细胞株:SGC-7901人胃癌细胞株，本室长期培养。(3)试剂与仪器:DMEM培养基(高糖)、胎牛血清、青链霉素均购自上海生工生物工程股份有限公司;胰蛋白酶购自上海实生细胞生物技术有限公司;四甲基偶氮唑盐购自Amresco公司;二甲基亚砜分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;染料碘化丙啶购自Sigma公司。酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3，芬兰)，荧光显微镜(Olympus BX-51，日本)，倒置显微镜(Olympus CKX41SF，日本)。

1.2 方法 (1)细胞培养:SGC-7901胃癌细胞株用含100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素、含10%FBS的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养传代，取对数生长期细胞实验。(2)实验方法:MTT法检测试验、TATP对SGC-7901细胞形状影响、单细胞凝胶电泳技术参考文献［4］。(3)分组:TATP组为SGC-7901胃癌细胞株(6例)，本实验室长期培养。对照组与正常人胃细胞株(6例)。

2 结果

2.1 TATP对细胞增殖的影响 TATP组各浓度和各药物处理时间与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。不同浓度的TATP能有效抑制 SGC-7901细胞增殖，且随着TATP浓度的增加和药物处理时间的延长，其抑制作用亦明显增强，并在一定的浓度与时间范围内表现出时效与量效关系。经计算TATP作用于人胃癌细胞24、48、72 h的 IC50分别为46.28、27.23、13.43 mg/L。

2.2 细胞形态 人胃癌细胞SGC-7901为上皮样细胞，贴壁伸展、紧密生长。显微镜下观察对照组细胞胞体大而饱满，呈铺路石状，折射率高，增殖旺盛;经TATP处理后细胞数减少，细胞胞体皱缩为圆形，折射率变弱，胞间距变大，贴壁能力减弱，随着TAPT浓度的增加，细胞脱落漂浮于培养基的现象越明显，且有少部分细胞出现肿大坏死现象。

2.3 TATP对细胞集落形成的影响 由表2可知，与对照组比较，各剂量组间差异均有统计学意义(P＜0.01)。不同浓度的TATP对SGC-7901细胞集落的形成均有抑制作用，且随着药物浓度的增加，集落形成率和相对增殖存活率明显下降。对照组SGC-7901细胞，集落多且大;浓度为10 mg/L的实验组细胞加药后有变圆趋势，生长缓慢，4 d后细胞开始分裂增殖，形成的集落较对照组小且松散;浓度为20 mg/L的实验组加药后细胞变圆且1周内未出现分裂增殖，形成的集落数目少且形状不规则;浓度为40 mg/L的实验组加药后细胞变圆且有脱落现象，形成集落很少，见表2，图1。

表2 不同浓度TATP对SGC-7901细胞集落形成的影响(±s，每组n=6)

表2 不同浓度TATP对SGC-7901细胞集落形成的影响(±s，每组n=6)

注:TATP:半夏总生物碱。与对照组比较aP＜0.01

组别 浓度(mg/L)集落形成数集落形成率(%)相对增殖存活率(%)对照组 0 154.67±11.56 30.93—TATP组 10 103.17±8.06 20.63a 66.70 20 48.64±6.54 9.73a 31.46 40 25.33±4.12 5.06a 16.36

表1 不同浓度TATP对SGC-7901细胞增殖的影响(±s，每组n=6)

表1 不同浓度TATP对SGC-7901细胞增殖的影响(±s，每组n=6)

注:TATP:半夏总生物碱。与对照组比较aP＜0.05，bP＜0.01

增殖情况(A值)抑制率(%)24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h对照组 0 0.525±0.033a 0.905±0.019a 1.337±0.025a — —组别 浓度(mg/L)—TATP组 2.5 0.513±0.023a 0.798±0.028b 1.069±0.018b 0.024 0.119 0.200 5 0.467±0.030b 0.766±0.022b 1.055±0.021b 0.112 0.154 0.211 10 0.444±0.031b 0.643±0.029b 0.767±0.022b 0.155 0.290 0.426 20 0.379±0.025b 0.485±0.023b 0.456±0.025b 0.279 0.464 0.659 30 0.348±0.024b 0.397±0.019b 0.260±0.018b 0.338 0.562 0.805 40 0.291±0.023b 0.299±0.021b 0.190±0.027b 0.445 0.669 0.858 50 0.247±0.019b 0.265±0.025b 0.147±0.030b 0.531 0.7070.890

图1 不同浓度的TATP对人胃癌SGC-7901细胞集落形成的影响(Giemsa染色×100)

2.4 TATP对细胞DNA的损伤作用 不同浓度TATP对SGC-7901细胞DNA均有不同程度的损伤，且随着浓度的增加，细胞拖尾越来越严重，头部有越来越小的趋势(图2)。用CASP彗星分析软件进行分析，结果列于表3。与对照组相比，各剂量组间尾DNA含量、尾长及尾动量差异均有统计学意义(P＜0.01)，且呈现一定的浓度依赖性。

图2 不同浓度的TATP造成的SGC-7901细胞拖尾情况

表3 不同浓度TATP作用24 h SGC-7901细胞拖尾变化(μm，±s，每组n=6)

表3 不同浓度TATP作用24 h SGC-7901细胞拖尾变化(μm，±s，每组n=6)

注:TATP:半夏总生物碱。与对照组比较aP＜0.01，bP＜0.05

(mg/L)对照组0 7.83±3.45 10.06±5.17 0.88±0.23 TATP组 10 16.30±4.29b39.29±9.46b 5.37±3.64b 20 24.57±5.41a 55.18±14.21a15.21±7.39a 40 37.58±7.77a70.45±19.99a24.83±9.67a含量 尾长 尾动量组别 浓度 尾DNA

3 讨论

胃癌是最常见的肿瘤之一，在非洲、欧洲和亚洲地区发病率较高，胃癌发病率位居第四，死亡率位居第三。胃癌在我国恶性肿瘤的发病率中居首位，其死亡率位居第二位［5-6］。目前从天然药物中筛选有效的活性物质已成为中国医学界的研究热点。大量实验研究表明，中医药能多环节、多靶位抑制肿瘤的发生、发展与转移，其主要作用机制有诱导细胞凋亡、抑制DNA合成、阻滞信号传导、抑制血管生成、控制端粒及端粒酶的稳定性、细胞毒作用、放化疗保护、逆转多药耐药以及抑制癌基因的表达等［6］。TATP是传统中药半夏的主要活性成分之一，孙欢等［2］研究发现TATP对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖有明显的抑制作用。周茜等［3］研究发现TATP对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用与加药浓度、时间呈正相关。陈芳等［1］研究发现随着TATP浓度的增加和加药时间的延长，其对人肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用也逐渐增强。本实验研究发现TATP能抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，降低集落形成率，并具有损伤癌细胞DNA作用。

肿瘤细胞具有无限制的自我更新能力，这与其增殖、侵袭及转移密切相关，抗肿瘤药物的干涉能影响细胞的这种能力。因此笔者检测了10、20、40 mg/L TATP对SGC-7901细胞集落形成的影响，发现TATP对胃癌细胞集落的形成亦有抑制作用，且随着浓度的增加，集落形成率和相对增殖存活率明显下降，进一步验证了 TATP对人胃癌细胞增殖具有抑制作用。

中药作用于癌细胞生长的各个阶段，导致细胞生长所需要的DNA、RNA、蛋白质断裂变性或合成受到严重破坏，从而使其停止于生长周期中的某一环节或导致死亡。单细胞凝胶电泳是一种高灵敏度的DNA断裂检测技术，广泛应用于细胞DNA损伤与修复、环境监测、遗传毒理、氧化应激以及细胞凋亡等研究中［7-8］。本实验研究结果表明，经10、20、40 mg/L的TATP处理24 h后，与对照组相比，TATP组细胞的尾DNA含量、尾长以及尾动量均有极显著差异，且随着药物浓度的增加，DNA损伤亦严重。

综上，TATP对人胃癌细胞SGC-7901具有明显的增殖抑制作用，且与药物浓度、加药时间呈正相关。其抑制作用可能通过诱导癌细胞的DNA损伤，阻止细胞分裂，诱导细胞凋亡，从而达到抑制癌细胞增殖。

［1］陈芳，唐瑛，文晔，等.半夏生物碱对人肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用［J］.中国比较医学杂志，2010，20(10):83-84.

［2］孙欢，唐瑛，周茜，等.半夏总生物碱对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用［J］.华南国防医学杂志，2012，26(5):9-12.

［3］周茜，唐瑛，孙欢，等.半夏总生物碱对人肺癌细胞增殖的抑制作用［J］.药学实践杂志，2013，31(1):38-41.

［4］Singh NP.Microgels for estimation of DNA strand breaks，DNA protein crosslinks and apoptosis［J］.Mutat Res，2000，455(1-2):111-127.

［5］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin 2011，61(2)，69-90.

［6］李鑫，卫蓉.中医中药治疗胃癌的研究进展［J］.贵阳中医学院学报，2012，34(1):116-119.

［7］Ross GM，McMillan TJ，Wilcox P，et al.The single cell microgel electrophoresis assay(comet assay):technical aspects and applications:Report on the 5th LH Gray Trust Workshop，Institute of Cancer Research，1994［J］.Mutat Res，1995，337(1):57-60.

［8］Collins AR.Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay［J］.Biochim Biophys Acta，2013，22(13):1-7.

(本文编辑:王映红)