干扰LOX基因对喉鳞癌Hep-2细胞增殖、侵袭及放疗敏感性的影响*

董凯峰 吕 欣 宋冬梅 刘志明 薛海涛 张翠红

喉鳞癌是临床较常见、病情发展迅速且治愈率较低的恶性肿瘤之一。探讨喉鳞癌增殖、侵袭的机制，寻找影响喉鳞癌治疗效果的相关基因，对临床治疗喉鳞癌具有重要意义。赖氨酰氧化酶（lysyl oxi⁃dase,LOX）属于糖蛋白，主要负责细胞外的胶原蛋白、结构性基质蛋白以及弹性蛋白赖氨酸源性交联的产生[1]。较早的研究发现，LOX在一些癌组织中表达下调，能抑制细胞恶性转化，具有抑制肿瘤的功能。但近期研究揭示，LOX对癌细胞侵袭、转移具有明显的促进作用[2-3]。以上提示LOX可能具备抑制肿瘤和促进转移的双重功能，但具体机制仍不清楚。RNA干扰具有高效性和高度特异性，其可阻断真核细胞中相关基因产物的表达，是近年来基因组学研究的热点。本研究通过阻断人喉鳞癌Hep-2细胞LOX mRNA及蛋白的表达，检测其对LOX、增殖细胞核抗原（Ki-67、PCNA）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表达，细胞凋亡及放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及细胞培养 喉鳞癌Hep-2细胞系购自北京协和医学院生物所。细胞培养条件：10%胎牛血清，青霉素0.1 μU/L，链霉素0.1 g/L，RPMI 1640培养基，于37℃，5% CO2环境下培养，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.1.2 抗体及试剂 LOXsiRNA、LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。免疫细胞化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细胞蛋白提取试剂盒购自北京普利莱公司；转染试剂盒购自CST公司；PI购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及转染 将Hep-2细胞分为3组，空白对照组（正常培养对照）、阴性对照组（转染试剂对照）、转染组（转染LOXsiRNA）；同时按照小RNA（siRNA）转染试剂盒说明进行转染。转染前将Hep-2细胞以5×104/孔铺于6孔板中，无血清无抗生素同步培养12 h。转染试剂同细胞共孵育4～6 h后吸弃，加入正常培养基培养24 h。

1.2.2 Real-time PCR法检测Hep-2细胞中的LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA表达 Trizol法提取细胞总RNA，取50 ng总RNA进行逆转录。Real-time PCR操作按照试剂盒说明进行，基因引物见表1。每一样品设3个复孔进行扩增。条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，28次循环。读取Ct值，计算3组的△Ct值=Ct目的基因–Ctβ-actin，△△Ct＝转染组△Ct–空白对照组△Ct，以2-△△CT代表目的基因的相对表达量。

1.2.3 Western blot法测定Hep-2细胞LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达 取Hep-2细胞总蛋白30 μg，与5×上样缓冲液按4∶1混合，100℃煮10 min，与蛋白质Marker一起上样，经12%SDS-PAGE分离胶电泳，再电转至PVDF膜上，TBS配制5%的脱脂奶粉溶液封闭1.5 h，抗体 1∶500 4℃孵育过夜，1×TBST溶液洗涤3次，每次10 min，PVDF膜与HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育1.5 h后，1×TBST溶液洗涤3次，每次10 min，ECL显色。实验重复3次，取其平均值。

1.2.4 MTT法检测不同剂量射线对Hep-2细胞生存率的影响 对数生长期Hep-2细胞接种至96孔板，分别给予不同剂量X射线（0、3、6、9、12、15、18 Gy）照射24 h后收取细胞，每组5个复孔，每孔加入10 μL MTT(5 g/L，无血清RPMI 1640配制后过滤除菌)37℃培养4 h后终止，每孔加入DMSO 2 000 μL，微板仪振荡10 min后，酶标仪检测490 nm各组吸光度（A）值。细胞生存率=（A转染组-A空白对照组）/（A阴性对照组-A空白对照组）。

Table 1 The primer sequences of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9,LOX and β-actin gene表1 PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX和β-actin基因引物序列

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 将Hep-2细胞分为空白对照组、阴性对照组、转染组、放疗组、转染+放疗组。转染方法同1.2.1。放疗组为给予剂量为12 Gy X射线照射细胞；转染+放疗组为转染12 h后，给予12 Gy X射线照射细胞，继续培养24 h后收集细胞；1 000 r/min离心5 min，弃去上清；4℃预冷PBS洗2遍，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入70%冰乙醇重悬固定，-20℃保存；上机前1 000 r/min离心5 min，弃乙醇，4℃预冷PBS洗3次；4℃预冷500 μL PBS制成细胞悬液，加RNaseA消化(终浓度50 mg/L)，4℃放置1 h，细胞浓度调整为1×106个/mL，加入0.1 g/L PI 500 μL，避光20 min，1 000 r/min离心5 min，4℃预冷PBS重悬，上机检测细胞凋亡，每个样本检测1×104个细胞。

1.3 统计学方法 SPSS 16.0统计软件进行处理，计量资料数据用±s表示，多样本均数比较采用F检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染LOXsiRNA对Hep-2细胞PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和LOX表达的影响 转染组PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和LOX mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组和空白对照组明显下调(P＜0.05)，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义，见表2、3，图1。

2.2 不同剂量的X射线对Hep-2细胞生存率的影响 不同剂量（0、3、6、9、12、15、18 Gy）X射线作用Hep-2细胞24 h，细胞生存率分别为(99.12±1.42)%、(90.32±1.32)%、(81.20±2.11)%、(73.35±1.23)%、(54.13±1.25)%、(51.26±2.42)%、(50.13±2.12)%，呈逐渐下降趋势(F=20.126，P＜0.05)，剂量为12、15、18 Gy时，细胞生存率明显低于剂量为9 Gy时，但3种剂量（12、15、18 Gy）组间差异无统计学意义，见图2。

Table 2 Comparison of relative mRNA expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表2各组PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX mRNA相对表达量比较 （±s）

Table 2 Comparison of relative mRNA expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表2各组PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX mRNA相对表达量比较 （±s）

＊P＜0.05；a与转染组比较，P＜0.05

PCNA Ki-67组别

Table 3 Comparison of relative protein expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表3各组PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX蛋白相对表达量比较 （±s）

Table 3 Comparison of relative protein expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表3各组PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX蛋白相对表达量比较 （±s）

＊P＜0.05；a与转染组比较，P＜0.05

组别空白对照组阴性对照组转染组F PCNA 60.21±1.99a 55.14±0.91a 21.22±0.31 22.186＊Ki-67 59.32±2.11a 50.31±1.61a 22.13±0.12 36.391＊组别空白对照组阴性对照组转染组F MMP-2 55.31±0.32a 53.22±0.87a 19.31±0.21 24.249＊MMP-9 54.43±0.67a 50.02±0.43a 21.41±0.54 30.173＊LOX 51.12±1.21a 49.11±1.31a 20.30±0.21 24.197＊

Figure 1 Results of Western blot analysis for protein expressions of LOX,Ki-67,PCNA,MMP-2 and MMP-9 in three groups of transfected Hep-2 cells图1 Western blot法分析3组Hep-2细胞LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达结果

Figure 2 The survival ratio of Hep-2 cells after different doses of radiation图2 不同剂量射线作用24 h对Hep-2细胞生存率的影响

2.3 转染LOXsiRNA对Hep-2细胞凋亡指数的影响 5组细胞凋亡指数（%）差异有统计学意义（F= 10.267，P＜0.05）。转染组（16.21±1.17）明显高于阴性对照组（4.95±1.12）和空白对照组(5.01±1.02)，空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义。转染+放疗组（79.11±1.26）明显高于阴性对照组、空白对照组、放疗组（43.21±2.12）及转染组，差异均有统计学意义。

3 讨论

喉鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤的侵袭、转移是造成患者死亡的主要因素，在这个过程中，许多肿瘤相关的增殖转移基因参与调控，如Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9，而最近的研究揭示，LOX对癌细胞转移存在明显的促进作用，LOX的生物学功能是作用于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的胶原和弹性纤维，催化产生一系列复杂反应，最终形成胶原与弹性纤维间的共价交联[4]，即通过此共价交联，发挥维持基底膜完整性，LOX的产生和调节在保持ECM的发育、成熟及结构的完整性方面起重要作用[5-6]。Erler等[2]研究指出LOX由缺氧诱导因子（HIF）-1α调控，与人类乳腺及头颈部肿瘤的缺氧有关。抑制LOX能降低原位乳腺癌在荷瘤小鼠模型中的转移，而肿瘤细胞自身可通过黏着斑激酶(focaladhesin kinase,FAK)的活性及细胞与基质的黏附，同时分泌LOX，可诱导缺氧环境下的人类癌细胞的侵袭。该研究还证明，缺氧环境下LOX mRNA及蛋白的含量明显增加，并且已分泌的LOX活性明显提高，从而促进了细胞侵袭性迁移，利于肿瘤的转移扩散。另外，由于LOX活性的增加及细胞的迁移导致ECM的轨迹被改变，提供了一条直接通路，使后续的细胞更易于移动，因此增加了细胞的迁移和侵袭[7-8]。

为进一步探讨LOX在喉鳞癌中可能发挥的作用，本研究采用RNA干扰技术，将LOX siRNA转染至喉鳞癌Hep-2细胞，观察LOX基因对喉鳞癌Hep-2细胞生长、凋亡以及增殖侵袭相关蛋白Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的影响。结果显示，转染组的LOX mRNA和蛋白表达受到显著抑制，表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组，细胞凋亡指数显著高于阴性及空白对照组，说明LOX表达越低，Hep-2细胞凋亡指数越高。另外，本研究结果显示，转染LOX siRNA后，Ki-67、PCNA蛋白的表达均明显降低，提示可能因下调LOX基因而影响Ki-67、PCNA的表达，Ki-67、PCNA的表达与细胞周期密切相关，在G1期时表达增加，在S期时明显表达，G2和M期达到峰值，在细胞有丝分裂后迅速下降，因此，Ki-67、PCNA被认为是一个能可靠地反映细胞增殖活性的客观指标[9-11]。肿瘤的浸润与转移的关键问题是ECM成分的降解，而MMPs能降解ECM，在恶性肿瘤的浸润和扩散中起重要作用。MMP-2是所有MMPs中分布最广的，当细胞恶变时，MMP-2常升高。MMP-9是MMPs中分子质量最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，一方面降解、破坏靠近肿瘤表面的ECM和基膜，使瘤细胞可沿着缺失的基膜向周围组织浸润，促进肿瘤侵袭和转移；另一方面可通过促进肿瘤内毛细血管新生，使肿瘤生长、扩散[12]。本研究结果显示，转染LOX siRNA后，Hep-2细胞中MMP-2、MMP-9表达明显减弱，提示降低LOX表达可使这些相关基因的表达下降，以此来调控肿瘤细胞的生长和增殖，达到治疗肿瘤的目的。然而相关基因在肿瘤发生、发展的不同阶段是如何相互影响的机制目前尚不清楚，可能与癌转移的生物学特性不同有关，有待于进一步研究。

X射线导致细胞死亡的一个主要途径是激活细胞的凋亡机制[13]。细胞凋亡是在基因控制下，通过主动的生化过程而发生自杀死亡的现象。细胞凋亡程序的修复可提高肿瘤细胞对放疗的敏感性。本研究结果显示，经剂量为12 Gy射线照射时，转染联合放疗组Hep-2细胞的凋亡指数明显高于阴性对照组、空白对照组、放疗组及转染组，提示LOX siRNA转染后具有增强放疗效果、抑制肿瘤细胞生长的作用，是增强放疗敏感性的一个潜在的分子靶位点，有可能在不改变放疗放射剂量前提下，增强放疗效果，为以后在基因水平上改变肿瘤细胞的放疗敏感性提供了线索。

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