RGD修饰的腺病毒介导的ING4对人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的影响

王奕鸿，刘济生，盛伟华，杨吉成

RGD修饰的腺病毒介导的ING4对人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的影响

王奕鸿，刘济生，盛伟华，杨吉成

目的研究RGD修饰的腺病毒介导的ING4对人鼻咽癌细胞(CNE)裸鼠移植瘤的影响并探讨其可能调节机制。方法 用RGD修饰的ING4单基因腺病毒载体(Ad．RGD-ING4)及腺病毒空载体(Ad．RGD-GFP)感染CNE细胞，RT-PCR法及Western blot法检测ING4基因的表达水平。采用CNE细胞株来建立15只人鼻咽癌裸鼠模型，分为PBS组、Ad．RGD-GFP及Ad．RGD-ING4组，每组5只。分别对瘤体内局部注射相应的干预用药，动态测量肿瘤体积，免疫组化检测Caspase-3基因的表达。结果 CNE细胞感染Ad．RGD-ING4 72 h后，ING4在CNE细胞中过表达，Ad．RGD-ING4组肿瘤体积明显小于PBS组及Ad．RGD-GFP组(P＜0．01)，免疫组化结果显示Ad．RGD-ING4组比其余两组Caspase-3基因的表达明显上调(P＜0．01)。结论 Ad．RGD-ING4抑制人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长，可能的机制是通过上调Caspase-3基因促进肿瘤细胞凋亡。

Ad．RGD-ING4;鼻咽肿瘤;基因，肿瘤;Caspase-3;裸鼠

鼻咽癌为我国发病率较高的肿瘤之一，大多为 低分化鳞癌，治疗以放疗或放化疗结合为主，但因其位置隐蔽，早期症状不典型，所以早期诊断及治疗比例低，远处转移率及复发率均较高。且因放疗或放化疗毒性作用及并发症较多，患者的依从性、耐受性仍然较差。随着科研水平的提高，我们对鼻咽癌的研究也越来越深入，生物基因治疗鼻咽癌的作用也日渐引起普遍关注。基因治疗是一种具有巨大潜力的新型肿瘤治疗策略。尤以腺病毒基因重组表达载体的肿瘤基因治疗研究应用较多。近年来发现和命名的 ING4是一种新型抑癌基因，于2003年被Shiseki等［1］鉴定，2004年在Nature杂志正式被认定为一种重要的肿瘤生长抑制因子［2］，其可以通过多种途径发挥特异性抗肿瘤效应，靶向诱导肿瘤细胞凋亡。因此，本研究用RGD修饰的ING4单基因腺病毒载体(Ad．RGD-ING4)感染人鼻咽癌细胞(CNE)裸鼠移植瘤，观察肿瘤的生长情况，并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 动物及试剂 雌性BALB/c裸鼠15只，4周龄，体重18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。Ad．RGD-ING4和RGD修饰的腺病毒空载体(Ad．RGD-GFP)由苏州大学基础医学院细胞和分子生物学教研室提供。CNE购自南京凯基生物有限公司，小牛血清及RPMI-1640购自GIBGO公司;各上下游引物购自南京金斯瑞生物技术有限公司;小鼠抗人ING4抗体购自Santa Crutz公司;β-actin抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，Dylight 800-Labeled Antibody荧光二抗购自美国KPL公司。Caspase-3抗体购自ABCAM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:含10%小牛血清的1640培养液培养CNE细胞，置37℃、5%CO2的细胞培养箱中，待细胞长满培养瓶，用0．25%胰酶进行消化传代。

1.2.2 测定RGD修饰的重组腺病毒对CNE的最佳感染复数(MOI):将对数生长期的CNE稀释成浓度为105/ml的细胞悬液，按每孔100μl接种于96孔板，继续培养。于24 h后将 Ad．RGD-GFP(1×109pfu/ml)分别以 MOI为 1、10、25、50、100、200 感染CNE，继续培养。每组各设5个复孔，72 h后观察细胞，细胞形态正常、以荧光强度达80%以上的最低感染剂量组为最佳MOI，实验重复3次。

1.2.3 RT-PCR及Western blot鉴定ING4基因的转录及翻译:将细胞分为CNE细胞对照组(PBS组):1 ×105/ml CNE+0．1 mol/L PBS;腺病毒空载体对照组(Ad．RGD-GFP组):1×105/ml CNE+最佳MOI Ad．RGD-GFP;ING4单基因治疗实验组(Ad．RGD-ING4组):1×105/ml CNE+最佳 MOI Ad．RGD-ING4。按上述分组用 PBS、Ad．RGD-GFP、Ad．RGD-ING4处理处于对数生长期的CNE细胞，感染72 h收集细胞用Trizol法分别抽提总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，用GAPDH-F:5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3'、GAPDH-R:5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3';ING4-F:5'-GCAAGCTTCTATTTCTTCTTCCGTTCTTGGGAG-3'、ING4-R:5'-ATTTGCGGCCGCATGGGGGTACTGCTCACACAGA-3'引物，参考PCR说明书并摸索退火温度进行PCR，检测腺病毒介导的外源性ING4基因在CNE细胞中的转录，实验重复3次。同上收集上述细胞，提取总蛋白上清，以4∶1比例与5×SDS蛋白上样缓冲液充分混匀，100℃煮沸5 min，然后进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶、分离胶浓度分别为5%、12%)，再把蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉将PVDF膜封闭后，分别用鼠抗人-actin抗体和鼠抗人ING4稀释液作用，用TBST洗涤3次，再分别加Dylight-800标记的荧光二抗，37℃避光1 h，TBST避光洗涤3次/5 min;最后在荧光成像仪上进行拍照，以上实验重复3次。

1.2.4 CNE裸鼠移植瘤模型的建立:用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养CNE细胞，放置在5%CO2、37℃的培养箱中。先用PBS洗涤处于对数生长期的CNE细胞，用0．25%胰酶消化，并离心5 min，收集细胞，并制备5．0×107/ml的细胞悬液。取4周龄SPF级BALB/c雌性裸鼠15只，裸鼠右前腋下用安尔碘常规消毒后，每只裸鼠皮下注射100μl的细胞悬液，并观察CNE细胞在裸鼠右前腋下成瘤情况。

1.2.5 实验的分组及处理方法:裸鼠皮下接种CNE 2周左右，待肿瘤长至200 mm3左右时，计为第0天，将裸鼠随机分成3组，每组5只，瘤体内多点注射干预药物，隔日1次，共注射6次。PBS组:每次注射100μl PBS;Ad．RGD-GFP组:每次注射1×109pfu/ml Ad．RGD-GFP 100 μl;Ad．RGD-ING4 组:每次注射1×109pfu/m l Ad．RGD-ING4 100 μl。

1.2.6 瘤体体积观察:第1次治疗前(记为0 d)及开始治疗后每隔1 d用游标卡尺测量各组裸鼠瘤体的长径(a)、短径(b)，从而计算肿瘤体积V=(a×b2)/2，共测量8次，观察不同时间移植瘤体积变化，并进一步分析Ad．RGD-ING4对裸鼠CNE移植瘤的抑瘤作用。

1.2.7 免疫组化检测:治疗15 d后，将裸鼠脱颈处死摘取瘤体，将各实验组的瘤体组织以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋并行组织切片，进行HE染色和免疫组化检测。HE染色用来观察各瘤体组织中细胞形态的变化，初步判断CNE细胞的凋亡情况。用免疫组化检测Caspase-3在CNE移植瘤中表达，以细胞质或细胞核内出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性细胞。将每组的每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6．0软件对每张照片进行分析，从而得出每张照片的累积光密度值即IOD值。IOD值越大，表示阳性表达越强。而每组所有照片的平均IOD值代表该实验组的IOD值。

1.3 统计学方法 应用SPSS 16．0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 RGD修饰的重组腺病毒的最佳MOI Ad．RGD-GFP 组中，MOI为 1、10、25、50、100 的 CNE 细胞荧光强度分别为5%、20%、55%、95%、98%，所感染的CNE细胞形态均正常，且生长良好，而MOI为200组中CNE细胞出现脱落、细胞形态发生变化，出现细胞毒性作用，并呈现强荧光100%;而MOI为50、100组均未见细胞毒性，并且有＞90%的CNE表达GFP荧光蛋白，提示腺病毒感染CNE细胞的最佳MOI为50剂量组。

2.2 ING4在CNE细胞中的表达 RT-PCR结果显示，Ad．RGD-ING4组在750 bp位置可检测到1条ING4特异性条带;Western blot显示Ad．RGD-ING4在相应位置可产生和抗ING4抗体结合的特异性条带，而PBS组和Ad．RGD-GFP组均没有出现相应的上述条带，见图1。RT-PCR及 Western blot鉴定Ad．RGD-ING4能介导外源性ING4基因在CNE细胞中成功转录及翻译。

2.3 CNE细胞裸鼠模型的建立 在裸鼠右前腋下的皮下接种CNE细胞，3 d内可见接种处皮丘慢慢变小，5 d后变成实性结节并逐渐增大，8 d后瘤体直径约1 cm，裸鼠成瘤率为100%(15/15)。

2.4 移植瘤体积的变化 治疗2周后，Ad．RGDING4组肿瘤体积增长缓慢，出现明显的抑瘤作用，从治疗第8天开始，Ad-ING4组的肿瘤体积与PBS组、Ad．RGD-GFP组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，而PBS组和Ad．RGD-GFP组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2、表1。

图1 RGD修饰的重组腺病毒介导的ING4在人鼻咽癌细胞中的表达

图2 3组裸鼠移植瘤体积－时间变化曲线

表1 3组裸鼠移植瘤体积随时间变化情况(±s，cm3)

表1 3组裸鼠移植瘤体积随时间变化情况(±s，cm3)

注:PBS组为CNE细胞对照组，Ad．RGD-GFP组为空病毒载体对照组，Ad．RGD-ING4组为ING4单基因治疗实验组;与PBS组同时间比较，b P ＜0．01，与 Ad．RGD-GFP 组同时间比较，d P ＜0．01

0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d组别 鼠数PBS 组 5 0．200 ±0．015 0．226 ±0．020 0．346 ±0．021 0．482 ±0．039 0．661 ±0．041 0．833 ±0．056 0．938 ±0．061 1．012 ±0．068 Ad．RGD-GFP 组 5 0．203 ±0．018 0．228 ±0．019 0．345 ±0．023 0．463 ±0．036 0．653 ±0．039 0．832 ±0．051 0．931 ±0．065 0．991 ±0．063 Ad．RGD-ING4 组 5 0．200 ±0．012 0．228 ±0．015 0．284 ±0．019 0．371 ±0．033 0．482 ±0．039bd 0．544 ±0．042bd 0．592 ±0．052bd 0．624 ±0．057 bd

2.5 移植瘤组织细胞形态学 PBS组和Ad．RGDGFP组中肿瘤细胞基本上形态正常，包膜完整，而Ad．RGD-ING4组中有部分细胞出现细胞膜不完整，细胞质浓缩，细胞核固缩、裂解或溶解，组织间有空泡形成，见图3。

2.6 移植瘤组织中Caspase-3的表达 Caspase-3的 IOD 值 PBS 组为 1801．30 ±167．36，Ad．RGDGFP组为 1829．73 ±165．23，Ad．RGD-ING4 组为6350．61 ±548．15。Ad．RGD-ING4 组 Caspase-3 的IOD值显著高于 PBS组和 Ad．RGD-GFP组(P＜0.01)。RGD-ING4组 Caspase-3阳性细胞数多于PBS组和 Ad．RGD-GFP组，见图4。

图3 裸鼠人鼻咽癌细胞移植瘤组织细胞形态学观察(HE×200)

图4 裸鼠人鼻咽癌细胞移植瘤中Caspase-3的表达(EnVision×200)

3 讨论

目前基因治疗与放疗、化疗及细胞因子等联合应用已成为研究热点之一，而选择合适的治疗基因是鼻咽癌基因治疗的关键。ING4基因在神经胶质瘤、头颈癌细胞等多种肿瘤中表达水平明显降低，而且与肿瘤发生、恶性程度、增殖和预后密切相关。在本实验中可以看到，鼻咽癌CNE细胞中ING4基因已基本失去表达，故我们选择重组腺病毒介导的ING4基因感染鼻咽癌细胞，使ING4基因在鼻咽癌细胞中出现过表达，从而发挥其抑癌功效。

前期已有文献［3-5］显示，ING4对肺癌、胰腺癌等肿瘤具有抑制生长、促进肿瘤细胞凋亡等作用。在本实验中，我们选择RGD修饰的腺病毒介导的ING4来研究ING4对鼻咽癌裸鼠移植瘤影响。RGD肽是一类含有精氨酸－甘氨酸－天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，在肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞表面通常呈高表达［6］，而在很多正常细胞膜表面αvβ3表达缺失［7］。因此，通过对腺病毒载体进行改造，使其衣壳蛋白表面表达RGD，可以明显提高载体的感染效率。

目前研究表明，细胞凋亡是一个受严格调控的能量依赖性的自杀程序，细胞凋亡的途径主要有两条:内源性途径(线粒体)和外源性途径(死亡受体途径)。外源性途径通过细胞表面的死亡受体配体结合而活化，主要管理免疫选择和炎症。内源性途径通过一些细胞内的刺激如电离辐射、化疗药物激活，通过Bcl-2家族中促凋亡基因(如Bax)及抗凋亡基因(如Bcl-2)的调控，特别是有研究发现，Bcl-2/Bax比率的升高可以引起细胞线粒体膜的通透性增加，释放出细胞色素C(Cyt-c)，介导凋亡体的生成，从而激活细胞质中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)［8-14］。最终，这两种途径所诱发的细胞凋亡都是通过起始 Caspase(如 Caspase-2，8，9，10)在外来蛋白信号的作用下被切割激活，起始Caspase激活执行者 Caspase(如 Caspase-3，6，7)，从而导致程序性细胞死亡［15-16］。其中，Caspase-3基因是Caspase大家族中重要的功能执行者，是细胞凋亡中的主要效应因子，也是细胞凋亡过程中的关键酶，大多数触发细胞凋亡的因素，最终均需要通过Caspase-3活化成Cleaved-Caspase-3，从而介导信号传导途径导致细胞凋亡［17-20］。本实验结果表明，Ad．RGD-ING4组裸鼠移植瘤较PBS组和Ad．RGDGFP组生长明显受到抑制，HE染色提示细胞凋亡数增多，免疫组化示Caspase-3的表达明显升高。

综上所述，Ad．RGD-ING4可以明显抑制人鼻咽癌细胞CNE裸鼠移植瘤的生长，其机制可能与明显上调凋亡基因Caspase-3表达有关。本文为 Ad．RGD-ING4基因治疗鼻咽癌提供了依据，为其临床应用奠定了基础。

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Effect of Adenovirus-mediated RGD-ING4 on Transplantation Tumor Induced by Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell in Nude Mice

WANG Yi-hong1，LIU Ji-sheng1，SHENGWei-hua2，YANG Ji-cheng2(1 DepartmentofOtolaryngology，the First Hospital Affiliated to Soochow University，Suzhou，Jiangsu 215006，China;2．Departmentof Cytology and Molecular Biology，College of Basic Medicine of Soochow University，Suzhou，Jiangsu 215123，China)

ObjectiveTo study the effect of Ad．RGD-ING4(adenovirus-mediated，Ad．)on transplantation tumor induced by human nasopharyngeal carcinoma cell CNE in nudemice and to investigate its possiblemechanisms．MethodsThe expression of ING4 gene in CNE cells，which were infected by Ad．RGD-ING4 or Ad．RGD-GFP，was detected by RT-PCR and Western blotmethods respectively．The 15models of human nasopharyngeal carcinomawere established with CNE cell strain in nudemice，and were divided into phosphate buffered sodium(PBS)group(n=5)，Ad．RGD-GFP group(n=5)and Ad．RGD-ING4 group(n=5)．Allmice underwent correspondingmulti-points injection in tumor respectively，the volume of tumor was measured dynamically，and the expressions of Caspase-3 gene in tumor sampleswere detected by immunohistochemistrymethod．ResultsThe ING4 protein was excessively expressed in the CNE cells after 72 h of being transfected by Ad．RGD-ING4．The tumor volume of Ad．RGD-ING4 group was significantly smaller than those of PBSand Ad．RGD-GFP groups(P ＜0．01)，and immunohistochemistry result showed that the expression of Caspase-3 gene was increased significantly in Ad．RGD-ING4 group compared with those in the other two groups(P ＜0．01)．ConclusionAd．RGD-ING4may inhibit the growth of transplantation tumor induced by human nasopharyngeal carcinoma cells in node mice，and up-regulation of Caspase-3 gene expression may accelerate tumor apoptosis．

Ad．RGD-ING4;Nasopharyngeal neoplasm;Gene，neoplasm;Caspase-3;Nudemouse

R739．6;R-332

A

2095-140X(2014)04-0050-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．04．015

苏州市科技计划项目(SYS201014)

215006江苏苏州，苏州大学附属第一医院耳鼻咽喉科(王奕鸿、刘济生);215006江苏 苏州，苏州大学基础医学院细胞与分子生物学教研室(盛伟华、杨吉成)

刘济生，E-mail:ljswwq@sina．com

book=0,ebook=61

2013-11-18 修回时间:2014-01-18)

·论著·