固定化中性蛋白酶制备水牛乳抗氧化活性肽的研究

钟兴业，杨志伟，李全阳，覃 慧，符雅慧，孙 艳

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

固定化中性蛋白酶制备水牛乳抗氧化活性肽的研究

钟兴业，杨志伟*，李全阳*，覃 慧，符雅慧，孙 艳

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

采用琼脂包埋固定中性蛋白酶，优化固定化条件，并利用固定化酶水解脱脂水牛乳生产具有抗氧化活性的酶解液，对其进行调配研制具有抗氧化活性的饮料。结果表明，最佳固定化条件为3%的琼脂、每克琼脂添加160mg中性蛋白酶、固定化时间为4h。固定化酶水解脱脂水牛乳最佳工艺为pH7.5、温度55℃、加酶量为2500U/g和酶解5h。

水牛乳，固定化酶，抗氧化活性

近来研究发现自由基引起大分子物质（如DNA、蛋白质、碳水化合物，脂类和核酸等）的变性、交联、断裂等氧化伤害，进而导致细胞结构和功能的破坏以及机体组织的损伤和器官的病变，从而引发各种疾病、癌变、老化等[1]。当体内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等内源性抗氧化酶无法维持体内自由基代谢平衡时，可以适当补充外源性抗氧化剂，从而提高机体抗氧化水平，维持体内氧化还原平衡，抵御自由基损害，帮助机体抵御疾病[2-5]。J.Pedroche等[6]利用琼脂糖包埋固定消化蛋白酶水解油菜芥蛋白得到具有抗氧化活性的水解物，为研究外源性抗氧化剂做准备。本研究利用琼脂固定中性蛋白酶水解水牛乳制备具有抗氧化活性的水牛乳蛋白肽，以DPPH自由基清除率指示抗氧化活性，其中DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，含有3个苯环，其中1个氮原子上有1个孤对电子，在517nm处有强吸收，抗氧化剂与DPPH自由基的孤对电子配对进而将吸收消失或减弱，通过计算EC50、TEC50（清除DPPH自由基50%时所用的时间）和AE（清除效率）等参数来反映抗氧化剂清除自由基的能力[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜水牛奶 白沙市场；中性蛋白酶 Solarbio公司；二苯代苦味酰基自由基（DPPH） Sigma公司；其他试剂 均为分析纯，由威佳试剂公司供应。

PB-10酸度计 Sartorius公司；UV5200紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；JRA-2数显磁力搅拌水浴锅 江苏省金坛市科杰仪器厂；LG10-2.4A离心机 北京医用离心机厂。

1.2 实验方法

1.2.1 琼脂固定中性蛋白酶[8]将琼脂粉煮沸溶解，置于55℃水浴，待温度恒定后加入酶液充分混匀，配制30m L 1%～5%的琼脂固定化酶液，并置于4℃冰箱中静置硬化1～6h。待琼脂冷凝后取出切成约2～4mm的小方块，用蒸馏水充分洗涤固定化酶，用吸水纸吸干表面水分，干燥后贮存于4℃冰箱中备用。

1.2.2 酶活力的测定[9]取酶液lm L（固定化酶0.2g），用0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2）稀释2000倍，取

1m L分别置于0、1、2、3号试管中，（0号试管再加入2m L，10%-三氯乙酸）于40℃水浴中预热3～5m in，加入预热（40℃）的2%干酪素1m L准确保温15m in后。加入10%三氯乙酸2m L（1、2、3号试管），四支管过滤除去沉淀，取清液1m L，加入0.55mol/L碳酸钠5m L，再加入福林-酚试剂1m L，于40℃水浴中显色15m in，在680nm波长比色，测OD680，以0号管为空白。固定化酶活力回收率（%）=。

1.2.3 水牛乳的脱脂 采用离心法对新鲜水牛乳进行脱脂，离心条件为：4℃下8000r/m in，离心10m in，离心后去掉上层脂肪。将脱脂水牛乳于冰箱中冷冻保藏备用。

1.2.4 固定化中性蛋白酶对脱脂水牛乳的酶解[10]取出冷冻脱脂水牛乳，50℃热水中解冻，用量筒量取100m L，加入100m L蒸馏水，置于500m L具塞三角瓶中，90℃预热处理5m in；取出冷却至固定化中性蛋白酶的最适反应温度，调节pH至固定化中性蛋白酶的最适值。置于磁力搅拌水浴锅上，在最适温度下，加入对固定化酶启动水解反应。反应过程用酸度计监控，以1mol/L的NaOH或HCl溶液维持pH恒定在其最适pH，记录水解过程中所消耗的NaOH或HCl溶液的量。水解至预定时间后，用纱布滤出固定化酶，酶解液调至pH 7.0，以8000r/m in离心10m in，取上清液进行测定。1.2.4.1 单因素实验 以水解度和DPPH自由基清除率为指标，考察pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、温度（45、50、55、60、65℃）、酶解时间（1、2、3、4、5、6h）以及加酶量（1000、1500、2000、2500、3000U/g）对酶解效果的影响。每个处理做3个重复实验。

1.2.4.2 酶解正交实验 分析单因素实验结果，选择酶解温度、pH、加酶量和酶解时间为因素，以DPPH自由基清除率为指标进行4因素3水平的正交实验。

表1 酶解正交实验因素水平表Table 1 Enzymatic orthogonal factor level table

式中：htot：单位质量蛋白质中肽键的总量（mmoL-1）；V：水解过程中所消耗的碱量（m L）；Nb：碱液的浓度（mol·L-1）；Mp：酶解液中蛋白质的质量（g）；α：α-氨基的平均解离度。

1.2.6 酶解产物清除DPPH自由基活性的测定[12]配制浓度为2×10-4mol·L-1DPPH无水乙醇溶液，避光保存。取2m L样品与2m L DPPH无水乙醇溶液混合，并剧烈振荡，在室温下避光反应30m in，然后在517nm处测定其吸光值Ai。空白组以等体积无水乙醇溶液替

1.2.5 水解度的测定[11]pH-stat法，水解度（DH）根据消耗的NaOH的量表示，按下式进行计算：代DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水替代样品溶液。DPPH自由基清除率用下式计算：

式中：A0—对照组吸光度；Ai—样品组吸光度；Aj—空白组吸光度。

1.3 统计分析

所有测试结果共进行三次重复，数据表示为平均值±标准误差。统计分析是采用SPSS17.0软件和m icrosoft Excel 2010。95%置信区间（p＜0.05）被确定为显著差异。

2 结果与讨论

2.1 琼脂固定化酶实验结果

2.1.1 琼脂浓度对固定化酶的影响 琼脂为亲水性胶体，分有条状和粉末状，不溶于冷水，易溶于热水，利用其凝固性、稳定性，能与蛋白酶形成络合物等物理化学性质，制备琼脂固定化酶。以120mg的中性蛋白酶和1g琼脂调配成不同琼脂浓度的琼脂与酶混合液，在4℃下硬化3h制成固定中性蛋白酶，测定其单位酶活力，计算出酶活力回收率，结果如表2所示。

表2 不同琼脂浓度的固定化酶特性和酶活力回收率Table 2 Property and activity recovery of immobilized enzymeunder different concentrations of agar

从表2可以看出，琼脂浓度为1%或2%，固定化酶凝胶较稀、网孔较大，质地较软，经蒸馏水冲洗后，中性蛋白酶损失较多，故酶活力回收率仅为16.23%和25.58%；而太高的琼脂含量又会导致固定化酶包埋致密、网孔太小，使底物向内扩散和产物向外扩散变得困难，导致底物缺乏和产物抑制，使固定化酶活力回收率下降，如琼脂浓度为5%时，固定化酶酶活力回收率仅为27.35%。所以最佳琼脂的质量分数为3%。

2.1.2 加酶量对固定化酶的影响 按要求取不同质量的中性蛋白酶和1g琼脂调配成3%琼脂浓度的琼脂与酶混合液，在4℃下硬化3h，制成固定化酶，测定其单位酶活力，计算出酶活力回收率，结果如图1所示。

随着加酶量的增长，固定化酶酶活力回收率先增大然后减小，当每克琼脂载体添加160mg中性蛋白酶时，酶活力回收率达到最大。这是因为过少的酶液会导致琼脂载体无法饱和吸附，造成载体的浪费；而过多的酶液加入，造成吸附在载体孔道内部的酶蛋白扩散阻力的增大，酶活力无法表现出来[13]。故选择每克琼脂添加160mg中性蛋白酶。

2.1.3 静置时间对固定化酶的影响 以120mg的中性蛋白酶和1g琼脂调配成3%琼脂浓度的琼脂与酶

的混合液，在4℃下硬化不同的时间，并测定固定化酶活性，以最大活性值为100%，计算各相对酶活力，结果见图2。

图1 不同加酶量的固定化酶酶活力回收率Fig.1 Activity recovery of immobilized enzyme under different adjunction of enzymes

图2 不同静置时间的相对酶活力Fig.2 Relative activity of immobilized enzyme under different standing time

固定化时间在1～4h时，固定化酶单位酶活力逐渐增大，但硬化超过4h后，随着时间的延长，固定化酶单位酶活力逐步下降。这是因为琼脂硬化后能够很好地形成凝胶，但如果固定化时间太长，形成的凝胶结构太紧密，会影响到酶促反应速率，固定化酶单位酶活力就会下降。故琼脂固定化时间选择为4h。在最优固定化条件下，得到的固定化中性蛋白酶酶活力回收率为40%。

2.2 固定化酶酶解脱脂乳单因素实验结果

2.2.1 温度对固定化酶酶解脱脂乳的影响 取等量脱脂水牛乳，按2000U/g添加固定化酶，按要求调节不同温度，在pH 7.0条件下酶解4h，温度对琼脂固定中性蛋白酶水解脱脂水牛乳的影响如图3所示。

从图3可以看出，随着反应温度的增加，固定化酶水解脱脂水牛乳反应的水解度和水解产物的DPPH自由基清除率都先增大再减小，反应温度达到55℃时，水解度和DPPH自由基清除率都达到最大值，分别为30.68%、62.40%。55℃以后，反应温度再增加，水解度和DPPH自由基清除率反而降低。因为酶促反应速率与温度有关，存在最适反应温度。在酶促反应的最初阶段，水牛乳蛋白的变性还未表现出来，因此反应速率随温度升高而增加，水解度也随之上升，抗氧化活性物质也越来越多；但高于最适温度时，固定化酶变性逐渐突出，反应速率随着温度升高的效应将逐渐为固定化酶的变性效应所抵消，反应速率迅速下降，水解度也随之下降，抗氧化物质也越来越少。因此选择55℃作为琼脂固定中性蛋白酶酶解脱脂水牛乳的最适反应温度。

图3 不同温度条件下水解样品的DPPH自由基清除率和水解度测定结果Fig.3 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under different temperature

2.2.2 pH对固定化酶酶解脱脂乳的影响 取等量脱脂水牛乳，按2000U/g添加固定化酶，按要求调节不同pH，在55℃条件下酶解4h，pH对琼脂固定中性蛋白酶水解脱脂水牛乳的影响如图4所示。

图4 不同pH条件下水解样品的DPPH自由基清除率和水解度测定结果Fig.4 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under different pH

从图4可以看出，随着反应液pH的增加，固定化酶水解脱脂水牛乳反应的水解度和水解产物的DPPH自由基清除率都先增大再减小，pH达到7.5时，水解度和DPPH自由基清除率都达到最大值，分别为32.09%、61.95%。pH7.5以后，随着反应液pH的增加，水解度和DPPH自由基清除率反而降低。综合以上结果，当pH为7.5时，水解反应具有最大的水解度，且其酶解液具有最高DPPH自由基清除率，原因是酶促反应具有最适pH，不在最适pH条件下，会抑制固定化酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物。因此选择pH 7.5作为琼脂固定中性蛋白酶酶解脱脂水牛乳的最适pH。

2.2.3 加酶量对固定化酶酶解脱脂乳的影响 取等量脱脂水牛乳，按要求添加固定化酶，在55℃，pH 7.0条件下酶解4h，加酶量对琼脂固定中性蛋白酶水解

脱脂水牛乳的影响如图5所示。

图5 不同加酶量条件下水解样品的DPPH自由基清除率和水解度测定结果Fig.5 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under differentadjunction of enzymes

从图5可以看出，随着每克底物蛋白加酶量的增加，固定化酶水解脱脂水牛乳反应的水解度不断的增加，当每克底物蛋白加酶量达到2000U以后，水解度无显著增加（p＞0.05）。水解产物的DPPH自由基清除率也随每克底物蛋白加酶量的增加而增加，当每克底物蛋白加酶量达到2000U以后，DPPH自由基清除率无显著增加（p＞0.05）。这说明在底物浓度不变的情况下，增加酶用量可以提高酶与底物的结合效率，但过量的酶分子抑制了中间产物向酶解反应终产物的转化，造成水解程度增加变缓慢，DPPH自由基清除率也趋于平缓。故选择每克蛋白加酶量为2000U。

2.2.4 酶解时间对固定化酶酶解脱脂乳的影响 取等量脱脂水牛乳，按2000U/g添加固定化酶，在55℃，pH7.0条件下酶解不同时间，酶解时间对琼脂固定中性蛋白酶水解脱脂水牛乳的影响如图6所示。

图6 不同酶解时间水解样品的DPPH自由基清除率和水解度测定结果Fig.6 Results of degree of hydrolysis and DPPH radicalscavenging capacity of hydrolysis under different hydrolysis time

从图6可以看出，随着水解时间的延长，固定化酶水解脱脂水牛乳反应的水解度不断的增加，当水解5h以后，水解度无显著增加（p＞0.05）。这是因为反应刚开始时，固定化酶与底物接触充分，水解度不断上升；反应一段时间后，底物变少，没有充分的结合位点与固定化酶结合，故水解度增加趋向平缓。同时，水解产物的DPPH自由基清除率也在水解5h的时候出现最大值达到62.63%，再延长反应时间，DPPH自由基清除率反而下降。这是因为反应5h以前，水解出抗氧化活性的物质多余抑制抗氧化活性的物质，但随着反应时间的延长水解出抑制抗氧化活性的物质越来越多。所以选择5h作为琼脂固定中性蛋白酶酶解脱脂水牛乳的最适反应时间。

2.3 固定化酶酶解脱脂乳正交实验

在单因素实验的基础上，选择pH、温度、加酶量和酶解时间为因素，以DPPH自由基清除率为指标选择表L9（34），进行琼脂固定化中性蛋白酶酶解脱脂水牛乳的正交实验。结果如表3所示。

表3 固定化酶酶解脱脂乳正交实验结果Table 3 Orthogonal results of hydrolysising skim milk by immobilized enzyme

从表3可知，影响水解产物DPPH自由基清除率的因素主次顺序为A（pH）＞C（加酶量）＞B（温度）＞D（酶解时间）。这是因为pH能有效抑制固定化酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物，而固定化酶对温度没有游离酶那么灵敏，固定化酶对温度有更强的耐受性，这结果与王君虹[14]和鹿波[15]的研究结果相同。最终确定最佳酶解条件为A2B2C3D2，即pH为7.5、温度为55℃、加酶量为2500U/g和酶解5h，与单因素实验结果一致。验证实验表明，在最佳工艺条件下，水解产物的DPPH自由基清除率达到65.24%。

3 讨论

前人研究主要集中在利用游离中性蛋白酶对水牛乳中乳清蛋白或酪蛋白进行酶解或者利用固定化酶对荷斯坦牛奶进行酶解调配，如同课题组的闭秋华等[16]利用中性蛋白酶对水牛乳中乳清蛋白进行酶解制备抗氧化活性肽，并优化了酶解条件；Fidel Toldra等[17]利用多孔玻璃微珠固定猪组织蛋白酶水解荷斯坦牛乳中酪蛋白制备生物活性肽；谢庆武等[18]利用壳聚糖共价交联固定中性蛋白酶水解荷斯坦牛乳中酪蛋白制备低苦味水解物。本文首次利用琼脂固定中性蛋白酶对水牛乳进行酶解并优化酶解条件，达到蛋白酶的重复多次利用，后面将以水牛乳酶解液进行调配得到色香味良好的水牛乳抗氧化活性饮料。

4 结论

琼脂固定中性蛋白酶，得到酶活力回收率达到40%的固定化酶，并利用固定化酶对脱脂水牛乳进行酶解，最佳酶解工艺为pH 7.5、温度55℃、加酶量为2500U/g和酶解5h，得到的水解产物的DPPH自由基清除率达到65.24%。后续研究还要对抗氧化活性肽进行超滤、大孔树脂脱盐，葡聚糖凝胶G-15和反相高效液相过滤，最后经过质谱得出具体的抗氧化肽分子量分布和氨基酸序列，且抗氧化活性肽的确定有待进一步研究。

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Study on preparation of antioxidant activity peptides of buffalo milk byimmobilized neutral protease

ZHONG Xing-ye，YANG Zhi-wei*，LIQuan-yang*，QIN Hui，FU Ya-hui，SUN Yan
（College of Light Industry and Food Engineering，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China）

Skim buffalo milk was hydrolyzed by immobilized enzyme which neutral protease was fixed to Agar forproduction of antioxidant hydrolyzate. The condition of immobilization and hydrolysis was optimized. Theantioxidant hydrolyzate was deployed to develop antioxidant activity beverages. Consequently，the optimumimmobilization conditions was obtained as 3% of agar，adjunction of neutral protease 160mg/g，immobilizationtime of 4h. Optimal parameters immobilized that enzyme hydrolyzed skim buffalo milk was drawn as pH7.5，temperature 55℃，enzyme dosage of 2500U/g and hydrolysis time of 5h.

buffalo milk；immobilized enzymes；antioxidant activity

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0192-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.035

2013－11－07 *通讯联系人

钟兴业（1988-），男，硕士研究生，研究方向：乳制品科学与技术。

广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻11107005-1D）。