猪瘟病毒C株杂交瘤细胞的构建及单克隆抗体的制备与鉴定

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（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730046）

猪瘟病毒C株杂交瘤细胞的构建及单克隆抗体的制备与鉴定

杨明1，陈伯祥1，郭慧琳2，李杰1，豆林涛1

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730046）

采用猪瘟病毒C株毒（CSFV C strain）免疫BALB/C小鼠，按照常规单克隆抗体制作方法构建并筛选出能稳定分泌抗猪瘟单克隆抗体杂交瘤细胞株4株，分别命名为1C9，1B11，3C8和3G9，经鉴定，4株单克隆抗体腹水效价达到104～106。交叉试验及特异性试验表明，所制备的McAb与鸽新城疫病毒、猪蓝耳病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、鸡减蛋综合征病毒无交叉反应性，均完全针对猪瘟病毒（CSFV）抗原决定簇，具有高度特异性。抗CSFV McAb的成功制备，为进一步研究建立CSFV的快速诊断方法奠定了基础。

猪瘟C株；杂交瘤细胞；单克隆抗体；鉴定

猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病，呈世界性分布，是猪的最重要传染病之一。猪感染了CSFV后不但发病造成较高的死亡率，而且还具有不断排毒的危险性。鉴于其危害程度高，对养猪业造成经济损失巨大，世界动物卫生组织（OIE）将本病列入法定报告传染病[1-3]。自50年代以来，随着猪瘟兔化弱毒中国株等疫苗的推广应用，我国猪瘟疫情得到了有效的控制。然而近年来国内外仍有猪瘟散发性流行的报道，其原因除了猪瘟病毒在野外长期驯化发生了变异外，还在于不能及时确诊而不能及早清除传染源。要消灭猪瘟就需要建立一种快速准确的诊断技术。单克隆抗体是具有高度特异性和灵敏性的免疫学诊断试剂，制备抗CSFV 单克隆抗体对猪瘟的临床诊断、病原学研究及其在宿主细胞中的增殖和定位都有重要意义[4-6]。本研究通过细胞融合技术制备了抗CSFV 单克隆抗体，为猪瘟快速诊断方法的建立奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及实验动物 猪瘟兔化弱毒株为猪瘟兔淋脾毒，由本所课题组保存；PK-15细胞，由中国农业科学院兰州兽医研究所馈赠；SP2/0细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；BALB/C小鼠，购自卫生部兰州生物制品研究所小动物室，18～20g，6～8周龄，雌性；家兔，购自卫生部兰州生物制品研究所小动物室，体重约1.5Kg；鸽新城疫病毒、猪蓝耳病病毒、猪传染性胃肠炎病毒PL株和SH株及EDS-76病毒均由本所课题组保存。

1.1.2 试剂 DMEM、RPMI-1640（GIBCO）；改良型RPMI-1640培养基（Hyclone）；新生牛血清、胎牛血清（杭州四季青）；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma）；L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、Hepes、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷、 氨基喋呤、8-氮鸟嘌呤、牛血清白蛋白、羊抗小鼠IgGHRP、Tween-20（Solarbio）；PEG1500（Merck）；30%H2O2（上海生工）；Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（Roche）；四蒸水（本实验室自制）。

1.1.3 主要器材 CO2培养箱（上海一恒）；DNM9602A型酶标分析仪（北京普朗）；倒置生物显微镜（广西）；-86℃超低温冰箱（上海枫田）；台式高速冷冻离心机（HEAL FORCE）；核酸蛋白检测仪四件套（上海天呈）；SP-752型紫外可见分光光度计（上海）；96孔、24孔细胞板（coaster）等耗材，均由Solarbio公司提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原制备

1.2.1.1 猪瘟兔化弱毒病毒液的制备 选择成年健康家兔4只，耳静脉注射处理好的猪瘟弱毒，1mL /只。另设对照4只，每隔12h测量家兔体温，当体温连续三次超过正常值1℃或1℃以上的家兔立即扑杀，无菌取其脾脏和肠系膜淋巴结，置无菌研钵研磨，加适量灭菌生理盐水，离心后取上清，制成猪瘟兔化弱毒病毒液备用。

1.2.1.2 病毒的浓缩和提纯 取培养24h、生长良好的80%单层PK-15细胞，吸出旧培养液，取CSFV弱毒株，用DMEM不完全培养基稀释，接种于细胞，加入量刚好盖过瓶底为止，塞好胶塞，感作1h，吸出病毒感染液，同时换上PK-15维持液，塞紧胶塞，置37℃培养箱继续培养。接种病毒60 h后的细胞反复冻融3次，收集毒液。在收集的病毒液中缓慢加入PEG6000和NaCl，摇匀，使最终浓度PEG6000为7.5%，NaCl为0.3M，1mol/L NaOH调pH值至7.5，置4℃过夜。第二天10000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀悬浮于pH7.5的TNE缓冲液（（0.05M Tris HCl，1M EDTA，0.1M NaCl） 中，约相当于原液的2%，置4℃冰箱过夜，其间搅拌几次。第二天4℃10000r/ min离心30min，去除沉淀，吸取上清液备用进行Sephadex G-200凝胶过滤。

1.2.1.3 Sephadex G-200凝胶纯化 将Sephadex G-200凝胶煮沸，漂洗，活化后装柱，平衡。取上一步浓缩物加至平衡好的Sephadex G-200柱子内进行纯化，用BSZ-100电子钟控自动部份收集器收集样品，用SP-752紫外可见分光光度计测量洗脱物的分布。用ELISA鉴定纯化后的猪瘟弱毒，测定蛋白含量后备用。

1.2.2 动物免疫 选6-8周龄雌性BALB/C小鼠，用上述提纯的猪瘟弱毒抗原，免疫3次，每次间隔两周，第一次抗原加等量的弗氏完全佐剂，经乳化分点注射于小鼠背部皮下，共注射0.2mL；第二次加等量的弗氏不完全佐剂，方法同前；第三次不加佐剂腿部肌肉注射，10d后尾部采血测血清效价，达到要求时于融合前3d加强免疫用不含佐剂的等量抗原腹腔注射，3d后融合。

1.2.3 检测猪瘟抗体间接ELISA方法的确定 将制备的病毒包被抗原稀释成150μg/mL，用包被液稀释抗原从1:5稀释到1:20，100μL /孔包被酶标板；将阳性和阴性血清用血清稀释液由1:200稀释到1:1000；用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释成由1:2400 稀释到1:8000，采用间接ELISA方法进行方阵实验。用酶标分析仪测定OD490值，记录结果。以P/N≥2.0的抗原、阳性、酶标二抗的最大稀释度作为抗原、阳性血清和酶标二抗的最适工作浓度。

1.2.4 杂交瘤细胞株的建立 将免疫好的小鼠眼球采血后，无菌取出脾脏，除去脂肪及结缔组织，将脾脏剪成小段，用灭菌注射器内芯碾压脾脏使淋巴细胞释放出来，吸出细胞悬液。1000r/min离心10min，脾细胞重悬于RPMI-1640不完全培养基中，计数，备用。将骨髓瘤细胞（SP2/0）融合前24h换液培养，融合当天，取生长良好细胞的用不完全RPMI-1640培养基轻轻吹下，收集，1000r/ min离心10min，重悬于不完全RPMI-1640培养基中，计数，备用。将SP2/0细胞及脾细胞两种细胞按l:10（1×107:1×108）的比例混合于离心管，用50%的PEG1500作为融合剂进行细胞融合，加入含1 %HAT的RPMI-1640完全培养基，小心吹散混匀细胞，在准备好饲养细胞的96孔板上每孔加入0.1mL融合细胞悬液置37℃5%的CO2培养箱中培养。融合后应每日观察细胞的生长情况。骨髓瘤细胞多在融合后2～3d内明显退化，细胞缩小、核浓缩、破碎。巨噬细胞增生、肥大，并开始吞噬细胞碎片。第6天可见隆状杂交廇细胞生长。此时观察判断每孔的细胞克隆情况，并作好记录。一般融合后6～7d，每孔移去HAT培养液0.1mL，补加等量的HT培养液。待融合后的细胞生长到覆盖细胞孔底部1/4～1/3时，细胞生长良好时，可用已建立的间接ELISA方法进行检测上清液中的抗体，检测为阳性的细胞孔采用有限稀释法进行克隆化培养，阴性孔3d后再检测一次，如仍为阴性则弃之。对阳性孔采用有限稀释法进行克隆，进行3次克隆和亚克隆，直到所有的孔都为阳性。最后选择OD490值高、细胞活力好的细胞孔，转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，及时冻存。

1.2.5 单克隆抗体腹水的生产 取10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡油进行预处理。1周后，将生长良好杂交瘤细胞的细胞轻吹下，1000r/min离心10min后弃上清，细胞重悬于不完全1640培养基中，计数并调细胞数至1.5×106个/mL。每只小鼠腹腔注射0.5mL。待小鼠腹部膨大，用注射器采集腹水，将腹水3000 r/ min离心20min，收集上清，分装后-80℃保存。

1.2.6 单克隆抗体效价测定 用猪瘟弱毒抗原包被酶标板，测定细胞培养上清液和腹水的效价，同时以SP2/0细胞培养上清和SP2/0诱生的阴性腹水做阴性作为对照。以P/N≥2.0的抗体最大稀释度作为效价终值。

1.2.7 单克隆抗体亚类及染色体数测定 采用Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit进行单克隆抗体亚型鉴定。染色体计数参照文献[7]介绍的方法进行。秋水仙素阻抑杂交瘤细胞分裂中期，加入KCl低渗处理，固定液固定，制片，染色镜检。

1.2.8 单克隆抗体特异性试验 用间接ELISA方法测定单克隆抗体分别与鸽新城疫病毒、猪蓝耳病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、鸡产蛋下降综合征病毒进行交叉反应试验。

1.2.9 杂交瘤细胞冻存和复苏及稳定性检验 杂交瘤细胞的冻存：选择处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下，1000 r/min离心10min，弃上清，用冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于细胞冻存管中，1mL/管，加盖封严，注明细胞名称，冻存日期。将冻存管置4℃冰箱1h，-20℃1h，转入-80℃冰箱过夜，次日移入液氮中。

杂交瘤细胞的复苏：从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水中，轻轻晃动使其尽快融化。1000 r/min离心10 min，弃上清。用含20%小牛血清RPMI-1640培养液将沉淀悬浮，加入细胞瓶，置37℃CO2培养箱内连续培养8代，并检测培养上清液中的抗体效价，检查细胞株分泌抗体的稳定性。

2 结果

2.1 猪瘟兔化弱毒病毒液的制备

猪瘟弱毒接种家兔后，家兔体温陆续升高，家兔体温变化情况见图1。对体温连续三次超过正常值1℃或1℃以上的家兔立即进行扑杀，取其淋巴结及脾脏，研磨加适当生理盐水离心后取上清制成病毒液。

图1 家兔体温曲线

从图1可见，1、2、3、4号兔在注射弱毒后，第三天体温开始超过正常体温，第四天可以捕杀采集病毒。

2.2 蛋白含量

纯化收集样品稀释后用SP-752紫外可见分光光度计测量OD2600.088和OD2800.072，50倍稀释。按公式（1.45×OD280～0.74×OD260）×稀释倍数，计算得浓缩抗原的蛋白含量为1.964mg/mL。

2.3 间接ELISA法检测单克隆重抗体中血清和酶最佳工作浓度的确定

根据矩阵法，将制备纯化的猪瘟病毒先用包被抗原稀释成150μg/mL，再用包被液稀释抗原确定纯化猪瘟病毒抗原最佳工作浓度为1:10，即最佳包被条件时病毒的蛋白含量为15μg/mL；阴阳性血清最佳工作浓度为1:600；最佳酶标二抗工作浓度为1:6400。

2.4 免疫小鼠血清效价

用分离提纯的猪瘟弱毒与弗氏佐剂等量乳化制备免疫抗原，小鼠通过背部皮下分点注射进行免疫，第三次不加佐剂后腿肌肉注射免疫，三次免疫后10d尾静脉采血分离血清，稀释后进行间接ELISA检测血清效价，结果见表1。

表1 小鼠免疫血清效价测定结果

2.5 细胞融合与克隆

将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG 1500方法进行细胞融合，经不断改进技术，最后细胞融合率达到了90%以上，阳性率为10%。将10株阳性单克隆细胞株用有限稀释法进行3次克隆，经检测和筛选最终获得能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，随着克隆代数的增加，细胞培养上清CSFV抗体OD490值逐步升高，到第3次克隆时最终达到稳定。

2.6 单克隆抗体腹水的制备及抗体效价

灭菌液体石蜡油处理BALB/C小鼠，1周后分别接种4株阳性杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，用注射器无菌抽取腹水。将腹水3000 r/min离心20 min，收集上清，进行效价测定，结果见表2。由表2可知，杂交瘤细胞的腹水抗体效价为104-106以上，细胞培养液的效价为1:1600-1:6400。

表2 不同杂交瘤细胞株在腹水和细胞培养液效价的测定结果

2.7 单克隆抗体亚类及染色体数测定

筛选出的4株单克隆细胞株经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit试剂盒检测后，3G9亚类为IgG1，1C9、1B11和3C8的抗体亚类均为lgG2b，4株单抗的轻链为κ链。经染色体计数，4株杂交瘤细胞株的平均染色体数为92～103条，符合杂交瘤细胞株的规律87～110条，与理论值相符。

2.8 单克隆抗体特异性试验

用间接ELISA检测单克隆抗体与其它病毒的交叉反应，结果发现它只与猪瘟病毒呈阳性反应，而与鸽新城疫病毒、猪呼吸繁殖综合症病毒、猪传染性胃肠炎病毒、鸡产蛋下降综合征病毒都不发生交叉反应，说明这4株单克隆抗体都是针对猪瘟病毒的特异性单克隆抗体。

2.9 杂交瘤细胞的稳定性检验

对4株克隆后杂交瘤细胞在冻存前后各连续培养8代，并用间接ELISA方法检测培养上清液中的抗体效价，结果传代过程中和复苏前后抗体效价没有明显变化，这说明各株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的能力稳定。

3 讨论

单克隆抗体是用预先免疫小鼠的脾细胞与能在体外无限生长的骨髓瘤细胞融合，形成具有双亲特征的杂交瘤细胞，通过克隆化得到来自单个细胞的杂交瘤细胞系，它们分泌的是针对同一抗原决定簇、分子具有高度同质性和特异性的抗体。单克隆抗体技术是1975年法国的Kohler和英国的Milstein用细胞融合技术获得了第一株能分泌抗羊红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞。此后，单克隆抗体的研制与应用已成为医学、动物学、生物学、农学和食品卫生等领域的研究热点[7]。

猪瘟病毒只有一个血清型，常规血清学方法很难将其从不同地区不同时间分离的毒株区分开来。近年的研究表明，不同地区分离的CSFV毒株的抗原性差异不大，但病毒的遗传特性上有差异。用单克隆抗体与不同毒株间的反应性的差别来分析CSFV不同毒株之间微小的抗原差异，是目前研究较多的一种较好的方法[8-10]。

1985年Wenvoort G C首次应用细胞培养的猪瘟病毒免疫小鼠建立和制备13株抗猪瘟病毒的McAb以来[11]，McAb不仅在猪瘟诊断方面得到广泛应用，而且越来越多的抗猪瘟病毒的McAb被制备并应用于猪瘟病毒的分子生物学研究。

猪瘟病毒为单股正链RNA病毒，其基因组编码一个多聚蛋白，经宿主细胞的病毒蛋白酶后产生4种结构蛋白和8种非结构蛋白，猪瘟病毒自然感染后，可产生针对E2、Erns和NS3蛋白的抗体，目前，国内外能够稳定分泌针对这三种蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞均有构建成功的报道[12-16]，国内外的学者也借助猪瘟单克隆抗体建立了一系列针对猪瘟的抗原和抗体诊断方法[17-20]。

用CSFV的McAb可用于引起猪瘟爆发流行的CSFV毒株进行流行病学跟踪研究。由于McAb具有一定的分“型”能力，只能检出病毒的表型差异，而不能检测到病毒的变异；而且，用于病毒分型的大部分McAb可能只对少数具有高免疫原性的位点呈现反应性，可能仅作用于该病毒的一小部分区域，故难以应用McAb全面和深入地阐明CSFV及其相关病毒的内在结构、组成和相互关系。目前PCR技术与核酸测序技术相结合被广泛用于猪瘟病毒的分子流行病学研究。

本试验以猪瘟弱毒免疫兔子，取其脾脏、淋巴结制备种毒，在PK15细胞是增殖，PEG6000浓缩病毒，经Sephadex G-200纯化后免疫BALB/C小鼠，经过多次细胞融合和亚克隆筛选，最终筛选出4株高效分泌抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。4株杂交瘤细胞的腹水抗体效价为达104-106以上，细胞培养液的效价为达1:1600-1:6400。单克隆抗体特异性鉴定和杂交瘤细胞稳定性测定等试验表明，所制备的单克隆抗体与其他抗原无交叉反应性，具有较高的特异性和敏感性；所制备的杂交瘤细胞无论是连续传代培养还是冻存后复苏传代均能稳定分泌特异性抗体。该单克隆抗体的成功制备，为下一步相关ELISA检测方法的建立、免疫层析快速诊断试纸的制备及基于单抗技术的猪瘟强弱毒的鉴别诊断方法的建立奠定了基础。

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Preparation and Identifcation of Monoclonal Antibodies against Classical Swine Fever Virus C Strain

Yang Ming1，Chen Boxiang1，Guo Huilin2，Li Jie1，Dou Lintao1
（1. Gansu Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Pingliang，Gansu 744000；2. Gansu Province Animal Disease Prevention and Control Center，Lanzhou，Gansu 730046）

Four monoclonal antibodies designated as 1C9，1B11，3C8 and 3G9 against classical swine fever virus C strain（CSFV C strain） were generated by immunization of BALB/C mice with purifed CSFV C strain. The titers of ascetic fuids of the four McAbs were up to 104～106in indirect ELISA. The McAbs were only positive against CSFV，and negative against Newcastle disease virus of pigeon，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，transmissible gastroenteritis virus and egg drop syndrome virus. The preparation of the McAbs provided a basis to establish rapid diagnostic method of CSFV．

CSFV C strain；hybridoma；monoclonal antibody；identifcation

S852.651

A

1005-944X（2014）08-0065-06

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2005-15）

陈伯祥