对一株鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定

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（1.兴化市陶庄兽医站，江苏兴化 225733；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

对一株鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定

徐荣妹1，刘金彪2

（1.兴化市陶庄兽医站，江苏兴化 225733；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

从江苏兴化地区某养鸭场的病鸭中采集样本，经分离培养、染色镜检、生化检测、凝集试验及PCR检测，分离到一株厌氧的革兰氏阴性短杆菌，并被鉴定为11型鸭疫里默氏杆菌，定名为JY-58株。

鸭疫里默氏杆菌；分离；鉴定

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的，主要侵害雏鸭等多种禽类的急性或慢性接触性传染病，该病呈急性或慢性败血症，常见症状为精神沉郁、流眼泪和流鼻液、轻度咳嗽、排绿色稀粪、共济失调、头颈震颤和昏迷。其特征性病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎[1]。鸭疫里默氏杆菌是一种革兰氏阴性、无鞭毛、无芽孢的棒状杆菌，瑞氏染色呈两极着色。本病最早在1932年发现于美国纽约州的长岛，其后在英国、加拿大、前苏联、澳大利亚等国亦有发生。我国于1982年首次报道本病的存在，各地均有发生，该病的发病率与死亡率都很高，是危害养鸭业的主要传染病之一。近年来，江苏地区蛋鸭和肉鸭饲养发展迅速，一些养鸭场疑似鸭疫里默氏杆菌病时有发生，我们对江苏兴化某规模化养鸭场的病死鸭进行了细菌分离，并鉴定为11型RA，定名为JY-58株，旨在为江苏省防制本病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料。江苏兴化地区某规模化养鸭场发生较大规模传染病。该养鸭场约有1万只3周龄左右的雏鸭，发病100只，死亡28只，病鸭表现为倦怠、缩颈、不食或少食、眼鼻有分泌物、腹泻、排淡绿色粪、行动迟缓、运动失调。无菌采取该鸭场病鸭肝脏，4℃保存备用。

1.1.2 菌种。2型鸭疫里默氏杆菌（RA-2）取自扬州大学兽医学院动物传染病学实验室。

1.1.3 试剂。LB培养基（OXOIDLTD，BASINGSTOKE，HAMPSHIRE，ENGLAND）；血清（海克隆生物化学制品有限公司）；微量发酵管（杭州天和微生物试剂有限公司）；Taq酶（晶美生物工程有限公司）；dNTP（上海生工生物工程技术服务有限公司）；琼脂糖（基因技术（上海）有限公司）；EB（美国BBI公司）。

1.2 方法

1.2.1 RA的分离。无菌条件下，用接种棒挑取病鸭肝脏组织，涂在血清LB平板上，厌氧培养（厌氧罐，并放入37℃温箱）；同时涂在麦康凯平板上，放入37℃培养箱中培养。

1.2.2 染色镜检。将血清LB平板上培养所得菌株分别进行瑞氏染色和革兰氏染色，并置显微镜下观察。

1.2.3 生化检测。采用微量发酵管进行葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、尿素酶、H2S和硝酸盐还原试验；吲哚、M-R、V-P、过氧化氢酶试验等参照文献[2-3]进行；运动力测定采用半固体穿刺法，同时设RA-2作阳性对照。

1.2.4 凝集试验。疑似菌株24h培养物按文献介绍[4]的方法进行玻板凝集试验，试验用鸭疫里氏杆菌1型、2型、3型、11型阳性血清均由扬州大学兽医学院动物传染病学实验室提供。

1.2.5 PCR鉴定及产物纯化。根据国外发表的RA序列[5]，用primer5.0设计软件进行引物设计，用来扩增大约546bps大小的基因片段。上游引物（P1）：5’–TTACCGACTGATTGCCTTCTAG 3；下游引物（P2）：5’–AGAGGAAGACCGAGGACATC 3；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

DNA的提取：本实验使用煮沸法提取DNA。①吸取分离株细菌液100µL，12000r/min离心5min；②去上清，加100µL超纯水重悬，离心，12000r/min，5min，重复3次；③加封口膜煮沸10min，冰浴10min；④12000r/min离心5min，取上清，作为模板DNA。

PCR反应体系：在25µL反应体系中进行PCR扩 增。2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL 模板DNA，0.5μL TaqDNA，0.5μL上 游引物，0.5μL下游引物，17μL dH2O，0.5μL dNTP， 1.5μL Mg2+，总量25μL；反应条件：95℃预变性4min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以核苷酸分子量DNA Marker 200确定目的条带的大小。

2 结果

2.1 染色镜检

分离菌株经瑞氏染色，略呈两极着色，为两极浓染的小杆菌；革兰氏染色呈阴性细小短杆菌，单个或成对分布。

2.2 生化检测

分离株生化检测结果显示：RA-2和JY-58分离物均不能发酵糖（-），皆能液化明胶（+），且分离物对过氧化氢酶分解都表现为阳性，其余各项全为阴性，基本符合RA的特征（表1）。

表1 分离菌株的生化检测结果

2.3 玻板凝集试验

该分离株与标准阳性血清进行反应，对11型阳性血清为明显凝集，鉴定为鸭疫里默氏杆菌11型（表2）。

表2 分离株玻板凝集试验结果

2.4 PCR检测结果

结果表明：RA-2株及JY-58菌株进行PCR扩增后产物经1%琼脂糖凝胶电泳，均出现600 bps左右大小的目的片段（图1），与预期大小基本相符。因此基本确定其为鸭疫里默氏杆菌。

3 讨论

图1 PCR检测结果

目前，鸭疫里氏杆菌感染呈全球性流行是造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一，其血清型呈多样性，已经报道的有21个血清型，不同的血清型间缺少交叉保护，加之用药治疗易产生耐药性，这给我国RA病的防控带来了很大困难。羊建中等在江苏苏中地区12家发病鸭场中分离到5种血清型的RA及未定型RA，证实该地区RA至少存在5种血清型，血清1、2、3型为主要血清型[4]。云水丽等在江苏新沂地区的病鸭体内分离到一株细菌，经病原分离鉴定证实为血清11型RA[1]。本试验是从江苏兴化地区的病鸭体内分离到一株细菌，鉴定为血清11型RA，与云水丽等报道的血清型一致，证明血清11型RA为目前该地区的主要血清型。如对该分离菌株进行进一步的生物学特性、毒力、最小致病力等方面的研究，研制针对该血清型的灭活疫苗对该病的预防控制具有重要意义[6]。

[1] 云水丽，杨勇，王小波，等.11型鸭疫里默氏杆菌分离鉴定及致病性研究[J].中国预防兽医学报，2009，31（8）：605-609.

[2] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：农业出版社，2001：126-127.

[3] 董渝，李文杨，程龙飞，等.3株鸭疫里默氏菌血清型鉴定及其生化特性的比较[J].福建农业大学学报，2000，29（1） ：87-89.

[4] 羊建平，王传锋.苏中地区鸭疫里氏杆菌血清学调查及多价疫苗的研制[J].畜牧与兽医，2006，38（4）：40-42.

[5] CrastaK C，Michael TJ. Identifcation and characterization of CAMP cohemolysin as a potential virulence factor of Riemerella anatipestifer[J].Bacterito，2002，184（7）：1932-1939.

[6] 王晓丽，王永明，龙冬，等.一例鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定[J].上海畜牧兽医通讯，2009（4）：18.

Isolation and identifcation of a strain of Riemerella anatipestifer

Xu Rongmei1，Liu Jinbiao2
（1. Taozhuang Veterinary Station of Xinghua City，Jiangsu 225733；2. College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Samples were collected from ill ducks in a duck farm in Xinghua area，Jiangsu province，and a strain of anaerobic gram-negative bacterium was obtained through isolation and culture，staining，biochemical test，agglutination test and PCR test，which was identifed as serotype 11 Riemerella anatipestifer，named as JY-58 strain.

Riemerella anatipestifer；isolation；identifcation

S852.615；S858.32

：B

：1005-944X（2014）08-0077-03

江苏高校优势学科建设工程资助项目

刘金彪