五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

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（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014；2. 长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410006）

五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

何世成1，林源1，王昌建1，刘道新1，谭 丹2，唐小明1，王卫国1，鲁杏华1，邱立新1，何玉玲1

（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014；2. 长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410006）

目的 研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性样品的相对提取效率，为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取，用荧光RT-PCR方法进行检测，获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值，分析五种提取方式的相对提取效率。结果 对合适的提取样品，磁珠提取法相对提取效率最高，吸附柱法其次，Trizol提取法相对效率较差；在三种磁珠提取法中，提取效率相差在2个CP值内，差异不明显，但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定，效率最高；国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。

RNA提取；PRRSV；TRIZOL；吸附柱；磁珠法

随着分子检测技术的广泛应用，核酸提取技术获得长足发展。第一代化学法，如异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法、Trizol提取法等操作繁琐、耗时、易污染，对人员技术水平要求较高；第二代为吸附柱提取法操作较简单、提取效率高、提取质量稳定；近年发展起来的第三代磁珠提取法提取效率更高，且可进行仪器自动化批量提取，在有批量提取要求的实验室中广受推崇[1-2]。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，在临床上能引起母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状，是严重威胁全球养猪业发展的重要传染病之一[3]。本研究以PRRSV阳性样品为对象，平行比较了五种不同提取方法提取效率的差异，旨在获取动物疫病监测实验室选择合适、可靠的核酸提取方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品

备用样品8份，其中4份为10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清样品，2份为PRRSV阳性的组织悬液，2份为PRRSV阳性的组织上清。制作方法为：PRRSV阳性血清解冻后，用0.01M pH7.2pBS作10倍梯度稀释，制成4个不同稀释度的样品备用；取两份PRRSV阳性猪扁桃体，在生物安全柜内各剪取少量组织用组织研磨仪进行研磨，将每份组织研磨后的混悬液一分为二，一份用于直接提取，一份经10000r/min离心1min后，取上清备用。所有样品来自于本实验室。

1.2 试剂或试剂盒

Trizol® LS Reagent，ambian公司产品，批号55174203；Simply P Total RNA Extraction Kit，BioFlux公司产品；Maxwell® 16 Tissue LEV Total RNA Purifcation Kit，Promega公司产品，批号016953；LabSerb Viral Total NA Kit，Fisher Scientifc公司产品，批号00LSKFR805496H14M020；Ex-RNA/DNA病毒核酸提取试剂盒，西安天隆科技有限公司产品，批号20130909；猪繁殖和呼吸综合症（蓝耳病）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），中山大学达安基因股份有限公司产品，批号2013003.

1.3 主要仪器设备

AS2000（LEV） 核酸提取仪，Promega公司产品；NP968核酸提取仪，西安天隆科技有限公司产品；KingFisher Flex核酸提取仪，Thermo公司产品；LightCycler480 II荧光定量PCR仪，Roche公司产品；5804R台式冷冻离心机，Eppendorf公司产品。

1.4 方法

1.4.1 Trizol提取。在离心管中依次加入750uL Trizol和250uL样品，震荡混匀，静置10min；加入200uL氯仿，混匀，静置10min，4℃离心15min；转移上清至一新离心管中，加入500uL异丙醇，混匀，静置20min，4℃离心10min；去上清，离心管倒置晾干，加1mL70%冰乙醇洗，离心5min；去上清，加1mL70%冰乙醇洗，离心5min；去上清，倒置晾干1h ；加入125uL无核酸酶水，适当震荡，离心，-70℃保存备用。

1.4.2 吸附柱提取。按照Simply P Total RNA Extraction Kit使用说明书中的操作方法，对100uL的样品进行RNA提取，用50uL洗脱液进行核酸洗脱。

1.4.3 Promega磁珠提取。运用Promega公司Maxwell16核酸提取仪以及其配套试剂Maxwell® 16 Tissue LEV Total RNA Purifcation Kit对样品进行磁珠法机器自动提取，操作按Promega公司推荐方法进行。起始样品量为200uL，核酸洗脱液体积为100uL。

1.4.4 天隆磁珠提取。运用西安天隆科技有限公司的核酸提取仪以及其配套试剂Ex-RNA/DNA病毒核酸提取试剂盒对样品进行磁珠法机器自动提取，操作按Promega公司推荐方法进行。起始样品量为200uL，核酸洗脱液体积为100uL。

1.4.5 LabServ磁珠提取。运用Thermo KingFisher Flex核酸提取仪以及其匹配试剂LabSerb Viral Total NA Kit对样品进行磁珠法机器自动提取，操作按Thermo公司推荐方法进行。起始样品量为200uL，核酸洗脱液体积为100uL。

1.4.6 RNA提取效率验证。对提取的核酸样品进行PRRSV荧光RT-PCR检测，利用结果CP值比较提取效率。

2 结果与分析

2.1 血清样品结果与分析

五种不同提取方法对4份10倍梯度稀释的血清样品所提核酸荧光RT-PCR结果的CP值见表1，同一样品不同提取方法CP值与最低CP值差值表见表2。结果显示，不同提取方法、不同样品在提取效率上均有差异，对同一样品，磁珠法提取效率最高，且三种磁珠法提取效率间差异较小（CP值差异在±2以内），吸附柱提取法其次，Trizol提取法提取效率最低，所提核酸的CP值最高，与最低CP值相比，最高差异达9.6，提取效率接近100倍。

表1 血清样品荧光RT-PCR 结果（CP值）

表2 同一样品不同提取方法CP值与最低CP值差值表

2.2 组织上清液样品结果与分析

五种不同提取方法对2份组织研磨液上清样品所提核酸荧光RT-PCR结果的CP值见表3，结果显示，对目标病毒核酸浓度较低的组组样品上清，五种提取方法CP值差异不大，在2以内，折算成提取效率，不超过4倍；就具体数据而言，以天隆磁珠提取法提取效率最高。

2.3 组织研磨混悬液样品结果与分析

组织研磨混悬液因未经离心，样品内组织块、细胞含量很高，除非经特殊裂解处理，一般不用于直接进行核酸提取。五种不同提取方法对2份组织研磨混悬液样品所提核酸荧光RT-PCR结果的CP值见表4。结果显示，Trizol提取法、吸附柱提取法、Promega磁珠提取对复杂样品的耐受更高，提取效率高于天隆磁珠提取法和LabServ磁珠提取法，提取效率相差约3个CP值左右，即10倍左右；相对于其上清样品（表3），提取效率下降2倍以上，最高为天隆磁珠提取法的5个CP值差异，效率下降约为32倍。

3 讨论

3.1 目前，核酸检测是病原学监测、检测的主要技术手段之一，也是临床运用最广泛的技术方法，而其前提是高质量、高效率的核酸提取。本试验以动物疫病监测中的主要监测对象之一——猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为对象，以荧光RT-PCR方法为评价手段，平行比较了5种核酸提取方法的相对提取效率，结果显示，对合适的提取样品，磁珠提取法相对提取效率最高，吸附柱法其次，Trizol提取法相对效率较差；在三种磁珠提取法中，提取效率差异不明显，但以天隆磁珠提取法提取效率更高。

3.2 本实验的5种提取方法中，Trizol提取法和吸附柱提取法为纯手工操作；LabServ磁珠提取法所有试剂、样品需手工加入，由仪器进行提取；Promega磁珠法和天隆磁珠提取法均为预装试剂，只少量试剂和样品需人工加入，由仪器进行提取，相较而言自动化程度较高。实验结果显示，自动化程度较高的Promega磁珠法和天隆磁珠提取法提取效率高于自动化程度较低的LabServ磁珠提取法，明显高于纯手工提取法，表明预装试剂的运用和仪器自动化操作有利于核酸提取效率的提高。

3.3 本实验中的5种提取方法其针对的样品均为清亮状态的液体样品，如拭子上清液、组织研磨离心后上清液、血清等。本实验中组织混悬液和组织上清的核酸提取结果显示，混悬液样品的核酸提取效率低于上清液样品的2-32倍，表明，过多的组织块及细胞含量，虽在理论上能增加细胞释放病毒的数量，但实际上无助于病毒核酸的提取效率。

3.4 报道称，国产核酸提取试剂其提取效率低于进口试剂，但在文献中无法获知国产试剂为何种产品[4-5]。本试验结果显示，作为国产仪器和国产试剂组合而成的天隆磁珠提取法在提取效率上不亚于进口仪器和进口试剂的组合，其原因可能在于近年来国产试剂和仪器设备制造水平厚积薄发的技术升级。

3.5 利用荧光定量RT-PCR结果的CP值（CT值）来比较不同核酸提取方法间的提取效率是目前的常用方法[4-10]。本次实验因成本因素，未进行大量样品对比实验和统计分析，实验的结果分析与结论非统计学结果，仅供临床使用者参考借鉴。

[1]刘洪波，刘晓雷，罗小铭.核酸提取方法进展[J].现代生物医学进展，2011（16）：3187-3190.

[2]张 丽，杨莲茹，吴绍强.核酸提取方法的研究进展[J].中国动物检疫，2011（12）：75-78.

[3] Straw BE，Zimmerman JJ，D’ Allaire S，et al//赵德明，张仲秋，沈建忠译.猪病学[M].九版. 北京：中国农业大学出版社，2008.

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[5]傅松哲，倪贤生，夏文，等.3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较[J].中国热带医学，2010（7）：783-785.

[6]龚黎明，葛琼，卢亦愚，等.4种核酸提取方法在流行性感冒病毒核酸检测中的比较[J].中国卫生检验杂志，2007（1）：53-54，90.

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Comparison of fve RNA extraction methods for extraction of PRRS virus nucleic acids

He Shicheng1，Lin Yuan1，Wang Changjian1，Liu Daoxin1，Tan Dang2，Tang Xiaoming1，Wang Weiguo1，Lu Xinhua1，Qiu Lixin1，He Yuling1
（1. Hunan Center for Animal Disease Prevention and Control，Changsha，Hunan 410014；2. Changsha Center for Animal Disease Prevention and Control，Changsha，Hunan 410006）

Aim To compare the extraction effciency of fve RNA extraction methods（Trizol RNA extraction method、adsorption column RNA extraction of BIOER，magnetic bead RNA extraction of Promega，XianTianlong and Thermo）for detection of PRRSV viruses，so as to provide technical reference for animal disease diagnostic laboratories in nucleic acid extraction.MethodsPRRSV RNAs were extracted using the 5 RNA extraction methods on positive serum samples of PRRS viruses diluted serially from 10-1to 10-4and 2 PRRSV positive tissue suspension and supernatant at the same time. The RNA preparations were quantifed by fuorescence real-time quantitative RT-PCR.ResultsFor the appropriate samples，the extraction effciency of magnetic bead was the highest；the adsorption column RNA extraction followed；and Trizol RNA extraction method was lower；there was 2 CP value deference among the three magnetic bead RNA extraction methods，indicating no obvious difference，but the Tianlong magnetic bead extraction effciency was higher relatively.ConclusionPre-installed reagent combination with automation magnetic beads to extract was stable and gave the highest effciency. The magnetic bead extraction effciency had no signifcant difference between the domestic and imported products.

RNA extraction；PRRSV；Trizol；adsorption column；magnetic bead extraction

R373.1

：A

：1005-944X（2014）08-0070-04