pGPH1-GFP-RKIP的构建及其对白血病细胞株CCRF-CEM化疗敏感性的影响

李 青，多力坤

(1武警兵团指挥部医院，乌鲁木齐830063;2新疆医科大学第一附属医院)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是最初分离自牛脑的一种相对分子质量小、结构高度保守的胞质蛋白，属于磷脂酰乙醇胺蛋白(PEBP)家族［1］。目前已发现，RKIP在人类和鼠、猴、鸡等动物的多种组织中表达［2］。RKIP曾被认为与磷脂膜生源和脂类代谢密切相关，但近年研究［3，4］发现，该蛋白能够通过干扰Raf与MEK的结合抑制Raf-MEK-细胞调节蛋白激酶(ERK)信号通路，从而被更名为RKIP。Raf-MEK-ERK信号通路在调节细胞生长、增殖和分化中发挥重要作用，其过度激活状态与多种肿瘤的发生和转移密切相关［5］，其特异性抑制分子RKIP被证实为多种肿瘤的抑制蛋白［6］。研究［7～11］表明，RKIP在多种白血病细胞中表达缺失，而其过表达能抑制儿童白血病细胞CCRF-CEM的Ras-ERK信号途径，并诱导细胞凋亡。本研究构建了RKIP的小分子干扰RNA(siRNA)质粒表达载体，并观察了其对白血病细胞CCRF-CEM化疗敏感性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 儿童白血病CCRF-CEM细胞系(美国ATCC);鼠抗人ERK单克隆抗体、兔抗人RKIP多克隆抗体、鼠抗人磷酸化ERK(p-ERK)单克隆抗体(美国Santa Cruz)，磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκB)抗体(Cell Signalinng，MA);PE-Anti Active caspase-3 Kit(Becton-Dickinson，美国)，DNA聚合酶KOD Plus(TOYOBO，日本)，总RNA提取试剂(TRIzol，Invitrogen公司)，限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA连接酶、dNTP(Biolab公司);9-硝基喜树碱(9NC，Sigma公司);第一链cDNA合成试剂盒(美国Invitrogen)，ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，DH5感受态细胞、DNA胶回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒(北京天根生物技术公司)，P-glycoprotein(Pgp) H1质粒载体;蛋白垂直电泳仪(北京六一仪器厂)，FACScalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)，倒置荧光显微镜(Olympus，日本)，电穿孔转染仪及转染试剂盒(Amaxa，Nucleofector Kit C，德国)。

1.2 试验方法

1.2.1 RKIP的siRNA质粒载体构建 参考Hagan等［11］研究，以RKIP的652-672核苷酸5＇-CCAGGCCGAGTGGGATGACTA-3＇为靶点，由上海吉玛公司合成含相应shDNA的碱基序列，序列如下(下划线部分为shDNA序列):5＇-GATCCCCCCAGGCCGAGTGGGATGACTATTCAAGAGA TAGTCATCCCACTCGGCCTGGTTTTTA-3＇;3＇-GGGGGTCCGGCTCACCCTACTGATAAGTTCTCTATCAGTAGGGTGAGCCGGACAAAATTCGA-5＇将合成的RKIP shDNA经限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ进行酶切、连接，热激转化至感受态细胞DH5α，经抗性筛选后获得含质粒pGPH1-绿色荧光蛋白(GFP)-RKIP的重组子，提取pGPH1-GFP-RKIP质粒并送吉玛公司测序鉴定，选取测序正确的pGPH1-GFP-RKIP质粒用于后续试验，菌株于-20℃保存备用。

1.2.2 重组质粒转染 取CCRF-CEM细胞以RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、50 IU青霉素和50 mg/L链霉素)培养至良好生长状态;按照Amaxa Nucleofector操作说明，取对数生长期CCRF-CEM细胞，采用X-001程序将质量浓度约1.0μg/μL的pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP质粒溶液各2.0μg转染至细胞，24 h后各取1×106个细胞用FACS检测细胞GFP转染效率，其余细胞培养72 h后收获，用于后续研究。

1.2.3 CCRF-CEM细胞内RKIP、p-IκBα、p-ERK表达检测 采用 Western blotting法。参考前期研究［10］方法，取转染pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP 72 h后的CCRF-CEM细胞各2×106个，在冰板上用细胞裂解液裂解10min，13 000 r/min离心5min，取上清行蛋白定量;取50μg细胞总蛋白进行SDS/ PAGE电泳、转膜。鼠抗人p-ERK抗体或兔抗人RKIP或鼠抗人ERK按1∶1 000稀释后标记PVDF膜，4℃震荡孵育过夜，用TBST清洗3次，用相应1∶5 000稀释的二抗标记PVDF膜1 h，再次用TBST清洗3次，用增强型发光液37℃孵育3 min，于暗室感光胶片。

1.2.4 9NC诱导后 CCRF-CEM细胞调亡率及RKIP表达检测 将转染pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP质粒72 h后的CCRF-CEM细胞各2×106个，接种于6孔板，分别以溶剂对照(聚乙二醇200)及5、10、20、50 nmol/L的9NC诱导细胞凋亡。24 h后收集上述细胞，用PE-Anti Active caspase-3 Kit检测caspase-3活性(反映细胞凋亡水平):将受试细胞用冰PBS清洗2遍，取1×106个用0.5 mL的Cytofix/Cytosperm溶液重悬;冰板放置20 min;离心后弃Cytofix/Cytosperm溶液，取1×106个细胞用0.5 mL清洗缓冲液洗2遍;加入100μL清洗缓冲液和10 μL抗体混合重悬，室温放置30 min;再次用1 mL的清洗缓冲液洗2次，用0.5 mL清洗缓冲液重悬，在流式细胞仪上样检测。同上检测RKIP表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，进行单因素方差分析;细胞凋亡率的比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒构建情况 经吉玛公司测序序列鉴定，pGPH1-GFP-RKIP重组质粒构建成功。

2.2 重组质粒转染效率 pGPH1-GFP-RKIP和 pGPH1-GFP的转染效率分别为90.04%、91.32%，能满足后续实验需求。

2.3 转染后细胞内RKIP、p-IκBα、p-ERK表达变化与转染对照质粒的细胞相比，转染pGPH1-GFPRKIP的细胞 RKIP表达水平下调 92.23% ± 10.23%(见图1)，p-ERK和p-IκBα表达明显上调，P均＜0.05(见图2)。

图1 转染后CCRF-CEM细胞RK IP表达

图2 转染后CCRF-CEM细胞内p-ERK和p-IκBα活性

2.4 9NC诱导后CCRF-CEM细胞凋亡率 9NC诱导24 h后，转染pGPH1-GFP及pGPH1-GFP-RKIP的细胞凋亡率分别为58.6% ±7.5%、35.8% ± 5.8%，两者相比，P＜0.05。

2.5 9NC诱导后CCRF-CEM细胞RKIP表达水平9NC处理 CCRF-CEM细胞 24 h后，20和 50 nmol/L两种剂量组RKIP表达水平显著上调，且有明显剂量依赖性(P＜0.05)。

图3 9NC处理后CCRF-CEM细胞RK IP表达变化

3 讨论

作为一种近年新发现的ERK信号通路抑制分子，RKIP能够通过抑制多种细胞ERK信号调节细胞增殖、分化和凋亡等生物学特性［3，4］，且在多种肿瘤的侵袭、生长、转移等过程中发挥作用。Briner等［12］对321例食管癌患者RKIP表达水平进行的回顾性调查发现，原发肿瘤的RKIP状态影响相应淋巴结和远端转移部位RKIP的表达;RKIP下调与总存活数(OS)和无病生存率(DFS)相关，是OS和DFS的独立预后因素，抑制RKIP下调可能降低食管癌弥散。Zhao等［13］报道提出，与癌旁组织和正常食管组织相比，食管癌组织的RKIP表达显著降低，且与肿瘤淋巴结和远端转移相关。Keller在进行前列腺癌体外调控基因筛查时发现，高度转移的前列腺癌组织RKIP表达水平低于低度转移者，RKIP表达可抑制前列腺癌侵袭、缺失则反之;体内试验表明，RKIP是前列腺癌转移的抑制基因，对原发肿瘤生长无影响;RKIP在非肿瘤患者前列腺中高表达，在50%原发前列腺癌中低表达，在大多数转移癌中低表达或缺失;此外，原发前列腺癌RKIP的低表达预示早期肿瘤发生;在小鼠动物模型，RKIP的缺失诱导前列腺癌的抗放射性［14］。上述研究提示，RKIP可能在肿瘤的发生、转移、预后中发挥重要作用。

本研究成功构建了RKIP的siRNA干扰质粒载体，并经过电转染方法建立了CCRF-CEM细胞转染模型，且转染后CCRF-CEM细胞的RKIP表达显著下调，完全可以满足试验要求。此为研究RKIP分子在儿童白血病细胞的生物学特征中的作用奠定了基础。本研究还显示，转染后细胞p-ERK和p-IκB表达也显著上调。提示RKIP对CCRF-CEM细胞ERK和IκB信号通路有强烈的抑制作用。此与文献［15，16］中有关前列腺癌和结直肠癌细胞的研究结果一致。此外，在9NC处理后，RKIP转染的CCRFCEM细胞凋亡率显著低于对照细胞，且具有浓度依赖性。提示RKIP表达下调可增加CCRF-CEM细胞对9NC的耐药率，9NC的抗癌作用很可能是通过上调RKIP完成的。Martinho等［17］新近研究也发现，宫颈癌对化疗药顺铂的耐药性与RKIP低表达相关。上述研究结果说明，RKIP表达下调可能是多种肿瘤细胞对化疗药耐受的机制之一。

总之，本研究成功构建了能够高效干扰RKIP的重组质粒载体;9NC诱导的CCRF-CEM细胞凋亡与RKIP上调相关，而RKIP干涉能降低CCRF-CEM细胞对9NC的化疗敏感性。

［1］Bernier I，Jolles P.Purification and characterization of a basic 23 kDa cytosolic protein from bovine brain［J］.Biochim Biophys Acta，1984，790(2):174-181.

［2］Antoun G，Bouchard-Cannon P，Cheng HY.Regulation ofMAPK/ ERK signaling and photic entrainment of the suprachiasmatic nucleus circadian clock by Raf kinase inhibitor protein［J］.JNeurosci，2012，32(14):4867-4877.

［3］Baritaki S，Chapman A，Yeung K，etal.Inhibition of epithelial to mesenchymal transition in metastatic prostate cancer cells by the novel proteasome inhibitor，NPI-0052:pivotal roles of Snail repression and RKIP induction［J］.Oncogene，2009，28(40):3573-3585.

［4］Zeng L，Imamoto A，Rosne MR，et al.Raf kinase inhibitory protein(RKIP):a physiological regulator and future therapeutic target［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12(10):1275-1287.

［5］Kolch W.Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(11):827-837.

［6］Escara-Wilke J，Yeung K，Keller ET.Raf kinase inhibitor protein (RKIP)in cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2012，31(3-4): 615-620.

［7］Fried I，Wölfler A，Quehenberger F，etal.Mutations in DNMT3A and loss of RKIP are independentevents in acutemonocytic leukemia［J］.Haematologica，2012，97(12):1936-1937.

［8］Zebisch A，Haller M，Hiden K，et al.Loss of RAF kinase inhibitor protein is a somatic event in the pathogenesis of therapy-related acutemyeloid leukemiaswith CRAF germlinemutations［J］.Leukemia，2009，23(6):1049-1053.

［9］Zebisch A，Wolfler A，Fried I，et al.Frequent loss of Raf kinase inhibitor protein expression in acutemyeloid leukemia［J］.Leukemia，2012，26(8):1842-1849.

［10］李青，多力坤.RKIP过表达对儿童白血病CCRF-CEM细胞系凋亡的影响与机制研究［J］.山东医药，2011，51(21):79-80.

［11］Hagan S，Al-Mulla F，Mallon E，et al.Reduction of Raf-1kinase inhibitor protein expression correlates with breast cancermetastasis［J］.Clin Cancer Res，2005，11(20):7392-7397.

［12］Birner P，Jesch B，Schultheis A，et al.Schoppmann RAF-kinase inhibitor protein(RKIP)downregulation in esophageal cancer and itsmetastases［J］.Clin Exp Metastasis，2012，29(6):551-559.

［13］Zhao D，Ma J，Shi J，etal.Raf kinase inhibitor protein inhibits esophageal cancer cell invasion through downregulation of matrix metalloproteinase expression［J］.Oncol Rep，2013，30(1):304-312.

［14］Keller ET.Role of Raf kinase inhibitor protein in pathophysiology of prostate cancer［J］.For Immunopathol Dis Therap，2011，2 (1):89-94.

［15］Fu Z，Smith PC，Zhang L，et al.Effects of raf kinase inhibitor protein expression on suppression of prostate cancermetastasis［J］.JNatl Cancer Inst，2003，95(12):878-889.

［16］Koelzer VH，Karamitopoulou E，Dawson H，et al.Geographic analysis of RKIP expression and its clinical relevance in colorectal cancer［J］.Br JCancer，2013，108(10):2088-2096.

［17］Martinho O，Pinto F，Granja S，et al.RKIP inhibition in cervical cancer is associated with higher tumor aggressive behavior and resistance to cisplatin therapy［J］.PLoSOne，2013，8(3):e59104.